结核分枝杆菌耐砒嗪酰胺pncA基因突变的检测医学论文.docVIP

结核分枝杆菌耐砒嗪酰胺pncA基 变的检测 ：徐龙强于红孙冰梅周本杰张文卿 I目的了解青岛市结核分枝杆菌(MTB)耐砒嗪酰胺(PZA) 分离株pncA基因的突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系。方法应 用BacT/ALERT 3D培养系统对25例MTB临床分离株进行常规培 养和药敏检测，通过PCR扩增pncA全长基因，DNA序列分析检测 pncA基因的突变情况。结果25株MTB临床分离株有22株扩增 出含pncA全基因的序列，进行DNA序列分析表明有6例发生了 pncA基因的突变，突变发生在pncA基因29、349^ 428、533、 539、541位的核苷酸，并导致PZA酶氨基酸序列的改变。结论pncA 基因突变是青岛市MTB临床分离株耐PZA的分子机制之一。 关键词】分枝杆菌，结核;砒嗪酰胺;抗药性;基因，pncA;序列分 析，DNA [ABSTRACT] Objective To investigate the mutation of pncA gene in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis (MTB) and the relationship between pncA gene and pyrazinamide (PZA) resistance strains in Qingdao area. Methods A routine MTB culture and drug susceptibility were done by BacT/ALERT 3D system in 25 clinical isolates of MTB, the pncA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and its mutation was analyzed by DNA sequencing. Results Of the 25 isolates, 22 strains were positive pncA gene by PCR amplification, and the DNA sequence showed that six mutations occurred in 29,349,428,533,539,541 codon of pncA gene，respectively, which resulted in changes of Pzase Amino acid sequence. Conclusion Mutation of pncA gene might be one of the major molecular mechanisms in PZA resistance of clinical isolates of MTB. ［KEY WORDS］ Mycobacterium tuberculosis; Pyrazinamide; Drug resistance; Gene, pncA; Sequence analysis, DNA 目前结核病仍是威胁人类健康的三大感染性疾病之一，是仅次于 艾滋病的第二大致死性感染性疾病。我国的结核病流行至今仍然严 重，属全球22个结核病高负担国家之一，目前全国约有600万例结 核病病人，每年约25万人死于结核病，结核病仍然是世界卫生组织 和我国重点防治的重大传染性疾病之一［1，2］。砒嗪酰胺(PZA)是尼 克酰胺的类似物，属一线的抗结核药物，PZA的体内具体作用机制 尚不十分明确，一般认为是由结核分枝杆菌(MTB)的吡嗪酰胺酶 (Pzase)将PZA转化成具有活性的毗嗪酸(POA)而发挥作用［3］。研究 表明，MTB对PZA耐药主要是由于编码Pzase的基因pncA发生 突变所致［4］。本实验应用BacT/ALERT 3D培养系统对MTB临床 分离株进行常规培养和药敏检测，PCR扩增pncA全长基因，并通 过DNA序列分析检测pncA基因的突变。旨在了解青岛市MTB耐 PZA分离株的pncA基因的突变情况，探讨其与耐PZA之间的关系。 1材料和方法 1.1标本来源 2008年6?8月，自青岛市胸科医院诊治的25例肺结核病人中 得到MTB临床分离株，其中初治病人22例，复治病人3例;年龄 20?76岁，平均51岁;男性20例，女性5例。 1.2主要试剂和仪器 MTB标准株H37Rv购自中国药品生物制品鉴定 所;BacT/ALERT 3D培养系统：法国梅里埃公司;UNIQ 10柱式 细菌基因组DNA抽提试剂盒、蛋白酶K、PCR所用的dNTP、Taq DNA聚合酶、PCR Marker等均购自上海生工生物工程技术服务有 限公司;DNA回收纯化试