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（五） 放射自显影技术 原理：利用放射性同位素的电离射线对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究 步骤：选合适的放射性前体分子做标记→按标记时间做标记→制片→曝光→再显影→定影→观察 特点:可以对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪 第五节 模式生物与功能基因组的研究 （一）细胞生物学研究常用的模式生物 理想的研究材料是研究成功的关键。 在生物研究中通常采用：噬菌体、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、四膜虫、黏菌海胆、拟南芥、斑马鱼和小鼠等 模式生物通常具有的特征是个体较小、容易培养、操作简单 大肠杆菌 原核生物的代表，一条环状DNA，大约编码4288个基因 特点：培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变、分离和鉴定容易 酵母 单细胞真核细胞的代表，有芽殖酵母，裂殖酵母 芽殖酵母好友16条线性染色体具有6000个可读框 裂殖酵母的基因分布在3条染色体上，编码约4800个蛋白质 线虫 成体长约1mm，由959个细胞组成 线虫繁殖快，生长周期为3天，在显微镜下通体透明。胚胎发育过程中细胞分裂、分化及死亡具有高度的程序性 果蝇 黑腹果蝇大约编码13600个基因作为遗传学的模式生物有100多年，与人类基因有很高的同源性 （二） 突变体制备技术 RNA干扰法包括瞬时干扰和永久干扰 RNAi 是利用一段特异的双链RNA或单链反义RNA通过注射、转染或转基因的方法导入到细胞或模式生物中 DNA敲除法 化学诱变法：喂食有化学诱变剂的食物造成配子染色体突变 特点：突变率高、但基因难定位 P因子介导的突变：利用转座子带走部分DNA序列改变基因 特点：突变率低、但针对性强 基于同源重组的定点突变：基于同源重组技术 特点：特异性高、受基因位置限制少、可在任意位点突变、但是相对耗时耗力 三 蛋白质组学技术 双向凝胶电泳 色谱技术 质谱 蛋白质芯片 生物信息学 * * 差速离心：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 密度梯度离心：将分离的细胞组分放在密度逐渐增加、高溶解度性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面通过重力或离心作用使样品中不同组分以不同速率沉降。 速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分 等密度沉降用于分离不同密度的组分 * 二 细胞组分的细胞化学显示方法 DNA：福尔根（Feulgen）反应－－紫红色 多糖类：PAS反应－－黄色 脂肪：苏丹III－－红色 蛋白质：米伦（Millon）－－红色 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂与所检测物质中的一些特殊基团特异性结合，显现出颜色来判断含量和分布的技术 * 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 显示方法 * 三 特异蛋白抗原的定位与定性 1、免疫荧光技术 将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白在细胞内的分布。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。 * A 直接免疫荧光标记技术：将荧光分子与抗体欧联后直接用于免疫标记技术 B 间接免疫标记技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体（称第二抗体）。 * 2 免疫电镜技术 将样品进行特殊标记增强反差，从而进行亚细胞结构和分子的定位。 特点: 分辨率高 根据标记方法不同分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。 * 四 细胞内特异核酸的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性通常采用原位杂交技术 原位杂交技术：用标记的核酸探针通过分子杂交确定 特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中的位置的方法。 * A 免疫胶体金标记技术原理示意图，细菌蛋白A可以与胶体金结合，也和与胶体的Fc端特异性结合 B免疫胶体金标记显示膀胱上皮细胞膜蛋白的分布 * 免疫胶体金技术： 胶体金是直径1-100mμm的金颗粒分散在水中形成的金溶胶。 特点： 特异性强 容易识别 分辨率高 * 五 定量细胞化学分析与细胞分选技术 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计 * 用途： 对单个细胞进行快速定量