课件：RNA提取系列.ppt

天根产品RNAstore Reagent—优势分析 延长保存时间 常温1周、37℃ 1天、 4℃至少保存1个月；组织4℃浸泡过夜后-20℃或-80℃可长期保存 方便操作 样本取出后，可方便进行切割、称重等操作 可反复冻融 冻存于-20℃或-80℃的组织可反复冻融至少20次不影响RNA质量 不影响下游应用 从RNAstore取出样本后，可直接使用TRNzol、 RNAprep pure、RNAsimple等RNA提取试剂盒提取 天根产品RNAstore Reagent—实验结果 反复冻融实验结果 保存时间实验 下游试剂兼容性实验 天根产品RNAstore Reagent—实验结果 * 大家好，我天根生化公司负责RNA及病毒研究专项的产品负责人，我叫周波，很高兴今天能在这里和大家共同讨论在RNA和病毒研究中关于核酸纯化方面的一些问题。 过渡词：各位老师都知道，RNA中的信使RNA是遗传信息的载体，提取RNA是分子生物学最基本的一项技术，但是因为RNA非常容易降解，这就增加了提取的难度。 * 在这里我想主要和大家讨论的是一些关于RNA的相关知识，以及在RNA提取前的准备以及提取过程中的一些注意事项，还有就是一些我们在RNA纯化过程中的常遇到的问题及分析，那么我们首先先看一下一些关于RNA的常识 * 我们都知道细胞中含有的RNA含量是非常少的，一般来讲在107个细胞中RNA总共也只有10ug左右，在RNA含量相对丰富的肝组织中要得到10ug的RNA也需要30mg肝组织，应用幼嫩的植物叶片组织，如大豆叶片，100mg左右也能得到10ug左右的RNA。而且在所提取的RNA中我们需要的仅是mRNA，只占RNA总量的1～5％左右，大部分是rRNA，占到80～85％，也就是我们电泳看到的28s和18s，还有一部分tRNA占10％左右。 大家可以看一下右面这张图，象小蘑菇一样的是核糖体，由蛋白和核糖体RNA组成，是蛋白质翻译的场所，象三叶草一样的是转运RNA，由它来负责运输氨基酸，信使RNA则携带有编码氨基酸序列的遗传密码子，可以看到核糖体RNA非常丰富，而带有polyA尾巴的信使RNA只占有很少的比例，同时在细胞中还有丰富的RNA酶。 * 在这里我想主要和大家讨论的是一些关于RNA的相关知识，以及在RNA提取前的准备以及提取过程中的一些注意事项，还有就是一些我们在RNA纯化过程中的常遇到的问题及分析，那么我们首先先看一下一些关于RNA的常识 * 在这里我想主要和大家讨论的是一些关于RNA的相关知识，以及在RNA提取前的准备以及提取过程中的一些注意事项，还有就是一些我们在RNA纯化过程中的常遇到的问题及分析，那么我们首先先看一下一些关于RNA的常识 * 上层水相含有RNA，中间层为基因组DNA，下层有机相含有蛋白，多糖等杂质。这样我们可以通过不同的方法分别提取得到RNA，DNA和蛋白。 过渡词：我们如何来分离纯化上层水相中的RNA呢？ * 这里有两种方法：一种是传统方法，沉淀法；另外一种方法是试剂盒中常用到的-柱纯化法。传统方法也就是将得到的上层水相加入等体积的异丙醇来沉淀RNA，然后用70%的乙醇洗涤沉淀，最后晾干溶解得到RNA溶液。这种方法的特点就是得率高。 柱纯化法是采用吸附柱来特异性地吸附RNA，通过漂洗去除杂质，最后用洗脱液将结合在吸附柱上的RNA洗脱下来。这种方法最大的特点就是得到的RNA纯度高。 过渡词：我们天根公司生产的RNAultra就是采用的柱纯化法来分离提纯RNA的。 S17：这是用RNAultra来柱纯化RNA的一个流程示意图：我们将上层水相吸到一个含有吸附柱的EP管中，RNA就吸附结合在硅质膜上，然后加入去蛋白液除蛋白，漂洗液除盐，最后用洗脱缓冲液将RNA从吸附柱上洗脱下来。 * 这个application是tiangen公司最近推出的TRNzol-A+和某公司同类产品进行的对比实验，应用106的hela细胞。右图为提取RNA的电泳图，其中123号为应用TIANGEN公司TRNzol-A+提取RNA，456为某公司同类产品，可以看出在提取得率方面TIANGEN公司TRNzol－A＋在得率和纯度上都要好于A公司同类产品 * 而应用RNAprep系列产品来提取RNA的流程主要有4个步骤，即裂解，结合，漂洗和洗脱，首先样本材料在胍盐/巯基乙醇下被裂解，然后离心使组织残渣和杂质沉淀将上清加入离心柱中，RNA会与离心柱中的硅基质膜结各，我给大家简单介绍一下硅基质的一些特性，硅基质会在高盐低ph条件下和核酸结合，在低盐高ph条件下被洗脱，所以在柱式提取RNA提取中的非常重要的两个因素是盐离子浓度和ph值，RNA和硅基质膜结合后我们就可以进行除盐和除蛋白杂质的的漂洗步骤了，通过不同