HBVDNA定量及变异检测的临床应用讲解材料.ppt

③分子信标（molecular beacon） ④light upon extention primers(LUX primers) 2.连接酶链反应（LCR） 四、HBV 基因分型 1.分型原理 全基因组序列差异=8%或S区DNA序列差异=4%定义为一个基因型，目前发现HBV存在A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型。 2.分型方法 （1）全基因组测序 优点：准确 缺点:耗时耗力，昂贵,需要测序仪 （2）限制性片段多态性分析（RFLP） 优点:特异性高 缺点:耗时，多用于科研 （3）PCR-ELISA 生物素包被微孔，将亲和素标记的探针固定在膜上，使用生物素或地高辛标记的引物扩增目标片段，扩增产物带有标记物，产物与探针结合。相继加入抗生物素或地高辛抗体，以后同ELISA。 优点：比PCR敏感几十倍，且 可以使用不同的探针进行分型，已经有商品化试剂盒 缺点:微量的污染即可导致假阳性且需进行PCR和ELISA两步操作。 (4)反向斑点杂交 原理基本同PCR-ELISA，不同的是将探针固定在同一张膜上，操作方便，所需PCR产物的体积小，已经开始在临床上广泛应用。 （5）Real-time PCR 是目前最流行最简便的方法。原理是根据不同的突变位点设计多对引物和探针，平行扩增，实时定量检测。 优点:定量，方便 缺点：需要多个反应体系 2.临床意义 （1）不同的基因型对药物的敏感性不同， A型对普通干扰素更敏感，长效干扰素对各型的作用基本相同。 （2）临床表现及预后不同。C型多为急性或重型肝炎，预后差 （3）地区差异，我国各型均有，北方以C型为多，南方多为B型，藏族地区以D型为主 （4) 基因的变异可以导致HBsAg和HBeAg阴性 五.YMDD检测的临床应用 1.定义 HBV P区编码的DNA聚合酶基因在739或741位点发生突变，其编码的HBV逆转录酶活性部位——“酪氨酸（Y）－蛋氨酸（M）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”(YMDD主型区)，变为“酪氨酸（Y）－缬氨酸（V）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”（YVDD）或“酪氨酸（Y）－异亮氨酸（I）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）”（YVDD）导致逆转录酶亚结构发生改变，妨碍了与拉米夫定的结合，从而造成HBV对拉米夫定敏感性下降。 Val------GTG YVDD Ile-------ATT ATC YIDD ATA Met-----ATG YMDD 图12. YMDD变异原理 HBV DNA定量和变异检测的临床应用 HBsAg Epidemicity 8% and above = High 2% - 8% = Intermediate Below 2% = Low 图1.HBV世界流行分布图 图2.2006年统计乙肝病毒携带者分布范围 注： 1.低流行地区：北美、北欧和英国等； 2.中流行区：南欧、西南亚、俄罗斯等； 3.高流行区： 2.乙肝病毒生物学特性 图3.乙肝病毒电镜图：A和C球形，B杆状 外壳：前S1抗原，S1抗原，S2抗原等； 核心：基因组，核心蛋白，DNA聚合酶等； 图4.乙肝病毒模式图 HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X(图26-2)，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因(核苷酸155～833)能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸(2，848-154)的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg。P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区(核苷酸1，374～1，835)可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。 图5.HBV DNA模式图 3.传染源:各种类型的乙肝患者和HBsAg携带者.潜伏期为6周至6个月，平均为3个月. 4.传播途径:由于HBV存在于血液，唾液、泪液、腹水、羊水、尿、精液、阴道分泌物、月经血和乳汁等中，所以传播途径多样且复杂.但主要经血液、母婴和接触传播. 1.高度敏感，可以将HBV的窗口期由60天缩短到49天。从理论上来说，每毫升血清只要有一个病毒就可以检出。 2.基因突变可以导致传统免疫学检测阴性，而基因检测可以避开突变区域，根据其高度保守区设计引物，使其检测结果不受突变影响。例如前核心区域的突变可以引入终止密码子，使 二、HBVDNA 定量检测的临床意义 HB