肝糖原地提取、鉴定与定量实验的报告.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 肝糖原的提取、鉴定与定量 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 FORMTEXT XX 教师签名 FORMTEXT 李某某 批改日期 20 FORMTEXT 13-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。? 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。? 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。? 5、正确掌握溶液转移的操作。? 6、正确操作使用分光光度计。 实验原理 1、肝糖原的提取与鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。?? CuSO4十2NaOH?=?Na2SO4+Cu(OH)2↓?? 2Cu(OH)2十C6H12O6?=?2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O?? 2CuOH?=?Cu2O↓(红色)+H2O?? Cu(OH)2=?CuO↓(黑色)+H2O 2、肝糖原定量测定 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。 三、材料与方法：以流程图示意 1、材料： （1）样品：鸡肝 （2）试剂：95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、蒽酮显色剂 （3）仪器和器材：普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板 2、方法： （1）肝糖原的提取与鉴定 混匀糖原水解液呈色对比+50%NaOH 5滴+浓HCL5滴沸水浴15min，冷却加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴沸水浴2min，溶解沉淀沉淀（弃去）鸡肝约1g，剪碎+5%CCl3COOH 1ml研磨至乳状+5%CCl3COOH 3ml研磨成肝匀浆 混匀 糖原水解液 呈色对比 +50%NaOH 5滴 +浓HCL5滴 沸水浴15min，冷却 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 糖原溶液2滴 沸水浴2min，溶解沉淀 沉淀（弃去） 鸡肝约1g，剪碎 +5%CCl3COOH 1ml 研磨至乳状 +5%CCl3COOH 3ml 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 上清液（取2ml） 离心5min（4000r/min） +2ml 95%乙醇，混匀，静置10min 沉淀 上清液（弃去） 白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml 糖原水解液2滴 +班氏试剂4滴 沸水浴2min，观察变化 （2）肝糖原定量测定 +30%KOH 1.5ml （用吸量管）在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液调零，测定并记录各管溶液的吸光度（A）沸水浴10min，冷却往空白管中加入蒸馏水1.0ml，标准管中加入标准葡萄糖溶液1.0ml，样品管中加入糖原提取液1.0ml加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液冷却，全部转入100ml容量瓶中取鸡肝0.15g于试管中沸水浴15min取3支试管，分别标记为空白管、标准管、样品管往三支试管中分别加入0.2%蒽酮溶液2.5ml，混匀 +30%KOH 1.5ml （用吸量管） 在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液调零，测定并记录各管溶液的吸光度（