天津农业大学仪器分析课件8高效液相色谱法.pptx

第十章高效液相色谱法 高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography, HPLC）又称高压液相色谱法。它是在经典色谱和气相色谱法的基础上发展起来的，在色谱理论方面没有本质的差别。但由于采用了高效固定相、高压输液泵、高灵敏度检测器等新技术，因而有了更高的效率并实现了自动化。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 第一节 高效液相色谱的固定相和流动相 （－）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 1.表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。 2．全多孔型固定相 它由直径为10μm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 （二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。下表列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 （3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50～IOOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离. 第二节 高效液相色谱的主要类型及选择 按分离原理可分为：吸附色谱（液－固吸附色谱）；分配色谱（液－液分配色谱）；离子交换色谱；体积排阻色谱（凝胶色谱、空间排阻色谱）。 一、液-固吸附色谱法 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据待分离的物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 1．分离原理当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。当待测试样分子（X）被流动相带入柱内，就要取代数目相当的已被吸附的流动相分子，于是，在固定相表面发生交换（竞争）吸附: Xm ＋ n Mad ＝ Xad ＋ nMm 竞争吸附达平衡时，有 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小，则保留值弱，易于洗脱，试样中各组分据此得以分离。2．固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。 3. 流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。液-固吸附色谱中常用有机溶剂作为流动相。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（?0）来衡量。 ?0 越大，表示洗脱剂的极性越强。表中列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的?0值。在硅胶吸附剂中?0值的顺序相同，数值可换算（ ?0硅胶＝0.77× ?0氧化铝）。 液固吸附色谱适用于分离那些能溶解在非极性溶剂