复方苗药对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用及其机制-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docx

20 2013 届硕士研究生学位论文 复方苗药对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用及其机制 PAGE PAGE 10 材料与方法 1 实验动物 健康成年 SD（Sprague Dawley）大鼠 72 只（无眼疾），体重在 180g~250g， 雌雄不限，由贵阳医学院实验动物中心提供（合格证号：SCXK（黔）[2002-0001]） 2 主要试剂 2.1 兔 SP 检测试剂盒 北京中山金桥生物技术有限公司 2.1.1 兔两 步法检 测 试剂盒 2.1.2 3%H2O2 去离子水 2.2 DAB 显色试 剂盒 北京中山金桥生物技术有限公司 2.3 Rabbit Anti－bcl-2 （c21） 武 汉博士德 生物工 程有 限公司 2.3 Rabbit Anti－ Bax (p-19) 武汉博士 德生物 工程 有限公司 2.4 Rabbit Anti－caspase-3(p11) 武汉博士 德生物 工程 有限公司 2.5 survivin 原 位杂交 检测试剂 盒 武汉博士 德生物 工程 有限公司 胃蛋白 酶（×10；Pepsin） 2ml 预杂交 液 2ml survivin 寡聚核 苷酸探针 杂交液 2ml 封闭液 5ml 2.5.5 生物素 化鼠抗 地高辛 5ml 2.5.6 SABC-POD 5ml 2.5.7 生物素 化过氧 化物酶 5ml 2.6 4%多聚甲醛 本院解剖学教研室提供 2.7 4%戊二醛 本院科技处电镜室提供 2.8 PBS 武汉博士德 生物工 程有 限公司 2.9 中性树脂 本院解剖学教研室提供 2.10 妥布霉素滴眼液(托百士) 比利时 S.A.ALCON-COUVREURN.V. （美国爱尔康眼药厂） 2.11 盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因) 比利时 2.12 苏木精伊红 本院组织胚胎学教研室提供 2.13 焦油紫染液 本院解剖学教研室提供 2.14 多聚赖氨酸(Poly-l-lysine) 武汉博士德生物工程有限公司 3 重要仪器设备 3.1 LKB-V 型超薄 切片机 第三军 医大学 电镜 中心 荷兰 PHILIPS TECNAI10 第三军医 大学电 镜中 心 透射电子 显微镜 OLYMPUS BH-2 显微镜 日本 3.4 LEICA RM2016 轮转切片 机 上海莱卡 仪器有 限公 司 (本院解 剖学 教研室 提 供) 3.5 电 热恒温 水浴箱 本院解剖 学教研 室提 供 3.6 电 子天平 本院解剖 学教研 室提 供 4 实验动物分组 随机分成 3 组：正常对照组、模型组、治疗组（五花血藤，透骨草，见血飞 等组方灌胃），然后按照不同再灌注时间段分为 2h、6h、12h、24h、48h、72h 组，各组随机分配 6 只大鼠。治疗组于术前，连续 3 d，2 次/d，（总剂量为 10g/kg·d） 给予复方苗药灌胃。对照组灌服相同剂量的生理盐水，并且持续到取材当日。 5 复方苗药制剂的制备 取五花血藤 20g，透骨草 15g，见血飞 15g 混匀。制成水煎浓缩剂，使生物 药浓度达 1g/ml，无菌密封后置入 4℃ 冰箱中保存备用。 6 动物模型的建立 利用升高眼内压致使视网膜血管断流以制造视网膜缺血模型。具体方法：大 鼠称重后以 0.6ml/100g（雌鼠）、0.7ml/100g（雄鼠）给予 5%水合氯醛腹腔注射 麻醉。麻醉后将大鼠侧卧位固定于实验台上，选取任一眼球，滴加复方托吡卡胺 滴眼液散瞳，盐酸丙米卡因滴眼液表面麻醉，5min 后，将一端连有生理盐水注 射液的 4 号半头皮针从大鼠颞侧角膜缘斜刺入眼前房，固定针头同时打开注射 器。固定输液瓶使其与眼球垂直距离为 150cm，眼压升高至 110mmHg，这时可 见大鼠瞳孔散大，巩膜变白。持续 60min，拔出针头，可见大鼠球结膜及巩膜颜 色迅速恢复正常，检眼镜下视网膜血供恢复，瞳孔回缩，说明造模成功。术中及 术后间断滴加妥布霉素滴眼液防止角膜干燥及预防感染。 7 标本的取材和固定 7.1 光镜及免疫组化标本取材和固定：在各个时间点，过量麻醉后给于心尖灌注 40ml/L 多聚甲醛溶液处死大鼠，立即取出眼球，经 Bouin 液（苦味酸饱和液、福 尔马林、冰醋酸以 15:5:1 配制）固定 24h（4℃冰箱）。标记备用。 7.2 电镜标本取材和固定：在各个时间点，迅速摘取大鼠眼球，在冰浴环境中沿 角膜缘切开，去角膜及晶状体，冰生理盐水冲洗干净，放入 4%戊二醛中固定 24h(4℃冰箱)。标记备用。 8 标本及其切片的制作 8.1 标本的制作 从冰箱中取出经 Bouin 液固定 24h 的标本，用流水冲洗 24h，之后再由蒸馏 水浸泡三次，每次 10 分钟。取出后放于干净滤纸上用眼科剪去掉角膜（保留晶 状体以保持其形态