低分子量肝素对肝癌细胞株增殖、黏附相关特性的影响及机制分析-临床检验诊断学专业论文.docx

PAGE PAGE 1 低分子量肝素对肝癌细胞株增殖、黏附相关特性的影响 及机制研究 摘 要 目的：（1）检测低分子量肝素对体外培养肝癌细胞增殖的影响，通过周期及周期 相关基因变化分析其分子机制。（2）检测低分子量肝素联合抗癌药物顺铂后对肝 癌细胞增殖的影响，分析低分子量肝素是否能够增强肝癌细胞对抗癌药物的敏感 性，并进一步探讨其可能机制。（3）检测低分子量肝素能否影响肝癌细胞侵袭迁 移过程的关键步骤—早期黏附，并探讨其相关机制。方法：（1）培养SMMC-7721 细胞，MTT比色法检测低分子量肝素作用后细胞生长情况。将对照组和低分子量 肝素处理组细胞培养36 h，以流式细胞术检测细胞周期分布的变化；RT-PCR法检 测各组细胞Skp2和c-Myc mRNA的变化情况；Western Blot检测各组Skp2和c-Myc 蛋白的表达变化。（2）体外培养SMMC-7721细胞，实验分为对照组、LMWH处理 组、DDP处理组和LMWH联合DDP处理组，分别给予相应的药物处理36h后，MTT 检测各组细胞存活率；AO/EB双荧光染色法及流式细胞术检测各组细胞凋亡率； Western Blot检测各组细胞的活化Caspase 3、Fas、Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。（3） Western Blot检测正常肝细胞株L-02，肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2三株细胞株 选择素配体SleX的表达量；RT-PCR检测经不同浓度肝癌细胞条件培养液刺激后的 脐静脉内皮细胞（HUVEC）的E-选择素表达情况；黏附试验检测三株细胞与经刺 激后的HUVECs的黏附情况。（4）选择SleX高表达细胞株HepG2作为肝癌细胞株代 表，分别与条件培养液组，条件培养液+LMWH低浓度组，条件培养液+LMWH高 浓度组处理的HUVECs共培养，检测发生黏附的细胞数目是否发生变化；RT-PCR 检测上述三种处理的HUVECs上E-选择素的表达情况。结果：（1）与对照组相比， 经低分子量肝素作用后的细胞的生长受到抑制，并在一定范围内呈时间和药物浓 度依赖性；分析细胞周期发现，随低分子量肝素剂量的增加，处于S期细胞的比例 下降（P0.05），而处于G0/G1期细胞比例显著上升（P0.05）；且Skp2和c-Myc的 mRNA和蛋白的表达量均呈现剂量依赖性减低（P0.05）。（2）与对照组相比，低 分子量肝素小剂量应用对SMMC-7721细胞的生长抑制不明显，但低分子量肝素联 合DDP应用后对细胞的抑制作用明显强于单独应用DDP处理组；凋亡检测结果显 示，小剂量LMWH单独应用不能明显增加细胞的凋亡率，但LMWH联合DDP应用 后，细胞的凋亡率明显强于DDP单独应用组；Western Blot检测发现联合用药组活 化Caspase 3表达明显增强；Fas在DDP单独用药组和联合用药组表达增高，但两者 表达量差别不大；Bcl-2仅在联合用药组表达明显降低，Bax仅在联合用药组表达明 显升高。（3）选择素配体SleX在L-02细胞株中几乎无表达，在SMMC-7721细胞株 中为低表达，在HepG2细胞株中为高表达；HUVECs经条件培养液刺激5h后，E- 选择素表达明显增加，且具有剂量依赖性。（4）低分子量肝素作用于经条件培养 液刺激的HUVECs后，黏附的HepG2细胞数目明显降低，具有剂量依赖性；通过 RT-PCR发现低分子量肝素能够剂量依赖性降低E-选择素的表达。结论：（1）低分 子量肝素能抑制肝癌细胞的生长，其机制可能与降低Skp2和c-Myc的基因表达，阻 滞细胞于G0/G1期，进而降低了细胞的增殖指数有关。（2）LMWH能增强DDP对肝 癌细胞的增殖抑制，其机制可能是联合应用LMWH后调节了细胞的凋亡途径。（3） LMWH能够通过抑制HUVECs上E-选择素的表达降低肝癌细胞与HUVECs的黏附。 关键词：人肝癌细胞；低分子量肝素；增殖抑制；细胞黏附；E-选择素；SleX Effects and mechanisms of low molecular weight heparin on the proliferation and adhesion in human liver cancer cells Objective (1) To detect the effects and molecular mechanisms of low molecular weight heparin on proliferation in vitro human liver cancer cells. (2) To detect the effects of low molecular weight heparin on cell proliferation