登革出血热登革休克综合症的免疫病理机制研究-病原生物学专业论文.docx

恻唰唰q 恻唰唰qdw m川唰aaT 唰肌川aaT 唰删唰AU 州州唰A-T 酬 阳刚8 恻恻恻mdE， 酬州Y 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出竟要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本卢明的法律约果由本人承担。 而‘ 学位论文作者签名:一哨的庐..J 例。年 IIT 月 I R 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校旬权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构i送交论文的电子版和纸质版，有拟将学 位论文用于非赢利目的的少量复信 IJ 并允许论文 j投入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。 保密论文保密期满后，适用本声明。 矿彷JJW吟f 川、 矿彷J JW 吟f 川 、 名 略 导 M ， H/问月/年b护仰年(?月 11H H / 问月 / 年 中山大学博士学位论文登革出血热/费，革休克综合症的兔班病理机制研究中文摘费 中山大学博士学位论文 登革出血热/费，革休克综合症的兔班病理机制研究 中文摘费 中山大学博士学位论文 登革出血热/号变革休克嫁合症的免疫病理机制研究 中文摘要 登革出血热/登革休克综合症的兔疫病理机制研究 中文摘要 研究背景 登革病毒 (dengue virus，D巴NV) 为黄病毒属单正股 RNA 病毒，分 1、2、3、 4 等四个血清型。登革病毒疾病是一类由 DENV 引起的，主要由蚊媒传播的，严 重危害人类健康的病毒性传染病。近年来 DENV 感染在全球范阁，尤其在热带、 亚热带地区呈递年上升趋势，流行区域正在扩大，巳成为世界上危害较大的一种 血媒病毒病，是全球重要的公共卫生问题。 DENV 感染所致疾病包括从较轻的登革热 (dengue feve民 DF) 到严熏致死性 的登革出血热 (dengue hemorrhagic feve民 DH肘，以及登革休克综合症 (dengue shock syndrome，DSS) 。血浆渗漏和出血症状是DHFIDSS 重要的临床特征， DHFIDSS 的主要病理生理改变包括: (1)血管通透性增加，患者出现白细胞数 最和功能改变、红细胞压积增加、血小板减少及凝血障碍。 (2) 血浆惨漏是 DHF 的主要临床表现，一般出现在迫热期:血浆大最进入腔隙中，血容量减少、血液 浓缩、血压降低，最终导致休克，引发 DSS。有关DHFIDSS 的致病机制目前仍 不清楚。 N别是 DENV 重要的非结构蛋白，在细胞感染过程中，以可溶性形式存在 于感染细胞内或细胞表丽。 N别是一种高度保守的糖蛋白，是病毒生存所必需的， 但是其确切功能还不清楚。以往研究表明 NSl 可能与病毒感染宿虫的血小板、 血管内皮细胞等具有相似的抗原决定簇，登革病毒可能通过分子模拟机制导致疾 病的发生:然而 NSl 具体的致病机制目前并未阐明。 研究目的 登革病毒致感染宿主发生 DHFIDSS 的免疫病理机制目前仍不清楚，以往研 究表明 NSl 可能在此免疫病理过程中发挥重要作用，但其具体机制仍有待研究。 E 11 11 本研究构建抗 NSl 抗体和 NSl 特异性丁细胞，从体液免疫和细胞免疫两个方面 系统地探讨 NSl 致病毒感染宿主血小板减少和血管渗漏的免疫病理机制，为进 一步揭示 DHFIDSS 的病理机制奠定基础。 研究方法 一、抗 NSl 抗体介辱的免疲病理作用研究 DENV2 NSl 的表达和纯化 采用毕赤酵母表达系统表达 DENV2 NSl ，6 x His 标签树脂过滤柱纯化 NSl ， 免疫印迹法鉴定 NSl 。 抗 NSl 抗体制备 NSl 加弗氏完全佐剂多点注射免疫 BAL B/c 小鼠，然后用 NSl 加弗氏不完 全佐剂多次腹腔注射加强免疫以获得抗 NSl 多克隆抗体， ELISA 法检测其抗体 效价。 3. 抗 NS 抗体的体外免疲病理作用研究 3.1 流式细胞术检测抗 NSl 抗体与血小板交叉反应性，免疫荧光法检测抗 NSl 抗体与血管内皮细胞 (Human microvascular endothelial cell 1.HMEC斗〉交叉反 应性。 3.2 抗 NSl 抗体与 HMEC斗细胞共培养，加入 BAL B/c 小鼠新鲜血清， ELISA 法检测培养上请中 C3a、C4a、C5a、sC5b-9 等补体活性成分含量。 3.3 HMEC斗细胞爬片培养，加入抗 NSl 抗体和 BALB/c 小鼠新鲜血清，免疫