实验十五：性磷酸酶的显示.pptVIP

实验十一：细胞内化学成分的显示方法——酸性磷酸酶的显示 【课前预习】 1．溶酶体分为几类，各有何特点？ 2．溶酶体是如何形成的？其标志酶是什么？如何在显微镜下显示？ 3．溶酶体具有哪些功能？ 【目的要求】 1．熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 2．观察酸性磷酸酶在细胞中的分布 【基本原理】 1．细胞化学：细胞化学是在保持细胞原有形态结构的基础上，利用已知的化学反应原位显示细胞内的某种化学成分，然后通过显微镜进行定性、定位、定量研究的科学。 2．细胞化学技术要求：保持样品的形态结构不发生改变；保存细胞内生前化学成分及酶的活性；显示成分的化学反应必须对将被显示的化学物质有高度特异性和高度灵敏性；反应所生成的产物要在原位沉淀、显色明显、不溶、不扩散，并在重复实验中结果一致。 3．染色的作用：由于正常的生物组织是无色透明的，因此无法在光镜下进行观察。因此必须要对样品进行染色；染色剂可以渗透到组织的间隙中，细胞中的蛋白质等成份可以吸附不同的色素粒子；染色剂中的阳离子和阴离子可分别与细胞中的酸性、碱性物质相结合。染色就是根据这些原理，利用染色剂与细胞内含物的物理作用与化学作用，将细胞和组织染成各种不同的颜色；由于染色剂的化学性质不同，以及固定材料时所用的固定剂不同，染色剂对被染色的组织有一定的选择性，从而使某些部位染色很清楚，而另一些部位可能完全不着色。例如，有些染色剂可染细胞核，有些染色剂可染细胞质。 4．染色的方法：（1）利用化学原理进行的染色方法：金属沉淀法：利用酶催化反应形成的分解产物与金属化合物反应，最终生成有色沉淀，借此辨认所要检查的酶的活性。偶氮偶联法：用人工合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合形成不溶性的偶氮色素。Schiff反应法：游离的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为紫红色产物，这种反应通常用于显示多糖类（PAS反应）和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。联苯胺法：过氧化物酶分解H2O2产生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。四唑盐显示脱氢酶；（2）利用物理学原理进行的染色：脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。荧光分析：借某些物质可被紫外线激发产生可见荧光而被显示。也可用荧光染色法将特定的荧光染料对细胞中的化学成分染色，在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。放射自显影技术：用放射性核素标记化合物，使其在细胞中参与代谢，将带有标记的代谢产物通过放射自显影技术显示出来，借以探测物质代谢途径和细胞增殖周期；（3）利用免疫学原理的染色方法：大分子物质具有免疫原性可制备特异抗体。用各种标记物如荧光素、辣根过氧化物酶和胶体金等标记该抗体，利用免疫学抗原抗体反应原理，用标记抗体显示相应抗原。 5．酸性磷酸酶的显示方法：酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉淀而被显示出来。 β-甘油磷酸钠 甘油+PO3- PO4 +Pb（NO3)2 Pb2（PO4)2 Pb2（PO4)4 +（NH4)2S PbS 【实验用品】 1．器材：注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片 2．试剂：3%淀粉溶液；ACP作用液；2%硫化铵 Gomori硝酸铅作用液 0.05mol／L醋酸缓冲液（pH5) lOOml 0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其 42ml 醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共200ml B-甘油磷酸钠 2g 醋酸铅 2g 5％氯化镁 5ml 以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过滤使用。 3．材料：小鼠腹腔液涂片 【方法步骤】 1．免疫动物：实验前4～6天用无菌注射器取已灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内，每天一次。 2．颈椎脱臼处死小鼠，打开腹腔。 3．吸取少量腹腔液，在玻片上涂层一薄层，室温晾干。 4．将涂片滴置于温盒中，滴加适量ACP作用液，37℃作用30分钟。取出后，蒸馏水漂洗。用10%甲醛钙溶液后固定5min。 5．玻片入2%硫化胺溶液作用2～3min，进行显色。取出后蒸馏水漂洗