低温驯化下黄粉虫抗冻蛋白基因应激表达-农业昆虫与害虫防治专业论文.docx

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 低温驯化下黄粉虫抗冻蛋白基因应激表达 低温驯化下黄粉虫抗冻蛋白基因应激表达 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 摘要 黄粉虫在遇到低温时会增高抗冻蛋白的表达，然而抗冻蛋白是一个基因家族，其 中蛋白的长度和结构存在着差异。在生物体的适应过程中，哪种抗冻蛋白的基因的表 达量更高，尚不清楚。本文就黄粉虫抗冻蛋白基因家族，保守序列长度存在差异的基 因进行研究，选取了黄粉虫抗冻蛋白基因家族中三个具有代表性的基因，NCBI 数据 库编号分别为：AF160497，AF160496，AF160494，进行了实时荧光定量 PCR，测定 其基因相对表达水平。处理如下，4°C 下驯化 4 天、8 天、16 天、24 后，对上述三个 基因的表达量进行了测定，同时还进行了 4°C 下低温驯化 4 天、8 天、16 天、24 天， 经-11°C 处理后，黄粉虫死亡率的统计。此外还进行了抗冻蛋白的在真核细胞 SF-9 中 的表达试验。 试验结果表明，随着黄粉虫在 4°C 下的处理时间延长，经-11°C 处理后，黄粉虫 的死亡率呈现下降的趋势，4 天、8 天、16 天都有明显的降低，24 天处理样本与 16 天处理样本的差异不显著。 黄粉虫 4°C 下驯化 4 天、8 天、16 天，分别取样对基因 Af160497 进行 RTPCR。 基因 Af160497 的表达量，在 4 天取样点表达量剧烈上升，而到了 8 天左右表达量则 低于 4 天，经过 16 天处理后基因的表达量继续增加，总体呈现上升趋势。 黄粉虫 4°C 下驯化 4 天、8 天、16 天，分别取样对基因 AF160496 进行 RTPCR。 基因 AF160496 的表达量，在 4 天取样点有了较大提升，在 8 天和 16 天取样现点，它 的表达量持续走低。 黄粉虫 4°C 下驯化 4 天、8 天、16 天，分别取样对基因 AF160494 进行 RTPCR。 基因 AF160494 的表达量，在 4 天的取样点也是有了很大提升，在 8 天取样的点表现 出与基因 Af160497 表达量降低，在 16 天取样点，该基因又恢复到 4 天取样点的表达 水平。 通过对三个基因的对比，基因 AF160494 的整体表达量高于其他两个处于主导地 位，AF160496、AF160497 基因表达水平相当，显著低于基因 AF160494 的表达水 平。 本研究中，检测了冷驯化对低温死亡率的效应和对不同类型的抗冻蛋白家族成员 基因表达量的影响。结果表明，冷驯化可以显著降低黄粉虫幼虫的低温死亡率和提高 不同类型抗冻蛋白基因的表达量。其中，长的抗冻蛋白和低温死亡率的相关关系最为 明显。说明不同的抗冻蛋白家族成员的功能有明显的分化，为进一步理解抗冻蛋白的 活性和利用抗冻蛋白提供了新的认识。 真核 SF-9 细胞表达抗冻蛋白过程中，完成了载体构建及杆粒的形成，并表达出 一定蛋白，但得到的蛋白分子量大小与实际存在差异，没有进行深入的研究。 关键词：黄粉虫 抗冻蛋白 基因表达量 死亡率 低温驯化 Abstract Tenebrio molitor, in the face of low temperatures, woμLd inhence the expression of antifreeze protein, however, there are many members in the antifreeze protein gene family, the length and structure of the members is different. It’s not clear, which antifreeze protein gene expression higher in the adaptation process. In this article, we selected three representative genes whose conserved sequence is different in length from Tenebrio molitor antifreeze protein gene family in NCBI. They are AF160497, AF160496 and AF160494. We determined relative gene expression levels using realtime fluorescence quantitative PCR. Handling as follows, Tenebrio molitor were accli- mated at 4°