弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合机制的初步研究-病原生物学专业论文.docx

PAGE PAGE 10 主要缩略语英文索引 缩略语 全 称 中 文 名 称 AA/aa Amino acid 氨基酸 Rab ras-like protein in rat brain 鼠脑 ras 样蛋白 BSA Albumin Bovine Serum 牛血清白蛋白 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP Deoxyn deoside triphosphate 脱氧三磷酸核苷酸 EEA-1 Early endosome antigen-1 早内体自身抗原 1 SNAREs Soluble NSF attachment protein receptor 可溶性 NSF 粘附蛋白受体 RILP Rab7-interacting lysosomal protein Rab7 交联溶酶体蛋白 mTOR  mammalian target of rapamycin 哺乳动物雷帕霉素作用靶 点 LB LB medium LB 培养基 NC Nitrocellulose 硝酸纤维素膜 PAGE polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosophate buffered saline 磷酸盐缓冲液 TRAF TNF Receptor Associated Factors 肿瘤坏死因子受体相关因子 rpm Revolutions per minute 每分钟转数 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 十二烷基硫酸钠 SDS SDS-polyacrylamide gel eletrophroresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 TBS Tris-buffered Saline Tris 缓冲盐溶液 TBST Tween20/ Tris-buffered Saline 吐温 20/Tris 缓冲盐溶液 Tris Tris-(Hydroxymethyl) aminomethane 三羟甲基氨基甲烷 弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合机制的初步研究 硕士研究生： 姜华 导 师： 杨秋林副教授 中 文 摘 要 目的：以弓形虫 PRU-T2 株感染巨噬细胞建立体外感染模型，免疫荧光技术检测含 虫空泡膜上介导其与溶酶体融合的三种蛋白（Rab5、Rab7、EEA-1）的动态变化。研 究弓形虫抑制含虫空泡与溶酶体融合的机制，为阐明弓形虫免疫逃逸的机制及合理设 计其疫苗提供实验依据。 方法： 1 建立体外弓形虫感染细胞模型 分别培养小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、 小鼠肺泡巨噬细胞、RAW264.7鼠传代巨噬细胞，用PRU-T2弓形虫感染细胞（以灭活 的PRU-T2弓形虫为阴性对照），分别于30 min、60 min、90 min及120 min取出盖玻片， 固定，瑞氏染色。比较弓形虫入侵以上4种细胞形成含虫空泡的时间与数量。选择合 适的细胞用于下一步研究。 2 间接免疫荧光技术分别检测Rab5、Rab7、EEA-1在含虫空泡膜上的动态分布 取对 数生长期细胞消化吹散；将细胞铺于预置有盖玻片的24孔板中，待细胞爬片后将弓形 虫加入到孔中感染巨噬细胞；取出盖玻片，用4%多聚甲醛固定10-30min；用0.5% Triton-100处理10-20min；加入2%胎牛白蛋白，37℃温箱中孵育1h封闭；加入适当稀 释比的一抗工作液，4℃过夜；洗涤，加二抗，37℃温箱中孵育1h；洗涤，晾干，摄 像。 结果： 1 比较了PRU-T2弓形虫感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、小鼠肺泡腔巨 噬细胞、RAW264.7细胞后对细胞状态的影响及含虫空泡形成的时间与数量。从接种 鼠腹腔取出4℃放置1-2天的虫体，分别感染小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏巨噬细胞、 小鼠肺泡腔巨噬细胞、RAW264.7细胞，于30min计数50个细胞中含虫泡的数量分别 是50、10-50、50-80、50-100。 2 Rab5 在含虫空泡膜上持续存在，在热灭活弓形虫吞噬体上随着时间的推移，含量下 降直至消失；在含虫空泡膜上检测不到 Rab7，在热灭活弓形虫吞噬体膜上 Rab7 含量 升高； EEA1（早内体自身抗原 1)在含虫空泡膜上无，在热灭活弓形虫吞噬体膜上存 在。 结论： 1 弓形虫侵入RAW264.7细胞形成含虫空泡的时间相对早、数量相对多。且RAW264.7 细胞容易培养，所以适合下一步研究。 2 Rab5、Rab7、EEA-1 三种蛋白在含虫空泡膜上的动态变化提示弓形虫可能通过保留 Rab5、排除 Rab7 而维持含虫空泡的早内体性质，并通过阻止 EEA-1 在含虫空泡上的 出现抑制含虫空泡与溶酶体的融合，从而达到免疫逃逸的目的。 关键词：Rab5、Rab