分泌过程中的功能分析-临床医学(内科学)专业论文.docx

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要? 生物体的生命活动是在多方面因素的严格调控下进行的，囊泡的分泌过程在对 生物体的调控作用中起着重要作用，是大多数宏观调控过程的分子基础。通过高分 辨率电子显微镜观察发现，囊泡可以分为致密核心大囊泡(LDCVs)和突触小囊泡(SVs) 两类。致密核心大囊泡中的内涵物主要是大分子蛋白质和神经肽类物质，突触小囊 泡中的内涵物则主要是一些神经递质。而近年来随着电生理技术和细胞成像技术的 迅猛发展，我们可以直接对活体细胞中囊泡的分泌事件进行高时间分辨率和高空间 分辨率的观测，从而研究在这一过程功能基团（如蛋白质）之间的相互作用及其作 用机理。 UNC-31 是由 S.Brenner 于 1974 年在筛选表型异常的 EMS 诱变的线虫时发现的。 缺失 UNC-31 的线虫表现出运动共济失调(UNC)、反应迟钝、产卵障碍等表型。其哺 乳动物中的同源物 CAPS(Ca2+-dependent activator protein for secretion) 于 1992 年在 鼠脑中发现，已经证实其一种与囊泡分泌过程中不可缺少的重要蛋白，随即成为分 泌研究领域中的热点对象之一。这一蛋白含有 5 个预测的功能结构域，从 N 端到 C 端，分别是动力蛋白激活蛋白 1 结合结构域(DBD)、C2 结构域、PH 结构域、Munc-13 同源结构域以及致密核心大囊泡结合结构域(DCVBD)。一些侧面研究(如同源序列比 对，竞争性过表达) 表明这些结构域有着各自的功能，但是尚无直接的证据证明这些 结构域确实在 UNC-31 行使其囊泡分泌相关功能中发挥作用或者仅仅是进化过程中 的无实际作用的遗留片段。 本文以此为切入点，将线虫作为模式生物，有机的结合了传统的线虫行为、药 理学分析和近年来兴起的电生理技术、全内反射细胞成像技术以及活体荧光检测技 术对这些结构域的功能进行了研究，这样就将微观上的分子或细胞水平上的观测结 果和宏观上的表型联系起来。我们的结果表明：综合来看，这些功能结构域对于 UNC-31 行使分泌过程中的功能是缺一不可的，但 Munc-13 同源结构域却表现出一些 ? 本研究课题得到国家自然科学基金 ，国家 973 基金(2006CB910701, 2010CB833701, 2007CB914202)资助。 I 特殊的性质。当线虫中的 UNC-31 缺少这一结构域时，其神经元细胞在电生理实验 中分泌状态正常，类似于野生型；而其他实验中,如果线虫中 UNC-31 缺少这一结构 域却都表现出类似于 UNC-31 基因缺失的突变体的表型。我们猜测这一异常的结果 可能是由于电生理实验中必须的较高的基础钙浓度导致的特殊现象。 关键词：胞吐作用，UNC-31/CAPS，线虫，锚定和激活，膜电容，全内反射荧光显 微镜（TIRFM） II PAGE IV PAGE IV Abstract? Life activities of organisms is under strict control by a variety of regulation factors, in which the secretion of vesicle plays an important role and is the molecular basis of macro-control process. Observed by high resolution electron microscopy, vesicles can be divided into large dense core vesicles (LDCVs) and synaptic vesicles (SVs) categories. Large dense core vesicles mainly contain macromolecular protein and neuropeptides, and synaptic vesicles mainly carry neurotransmitter. With the rapid development of electrophysiological techniques and cellular imaging technology in recent years, we can directly monitor secretory vesicles in the high time resolution and high spatial resolution on the living cells, and to