酶促反应动力学实验-新.docVIP

酶动力学综合实验 实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶： 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程： Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即： QUOTE (1) 式中：v表示酶促反应速度， QUOTE 表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度， QUOTE 表示米氏常数。 3、 QUOTE 值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2 QUOTE 时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测 QUOTE 一个近似值，因而1/2 QUOTE 不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 ② Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b） 实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式： QUOTE (2) 以 QUOTE 对 QUOTE 作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为 QUOTE ，纵截距为 QUOTE 。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为— QUOTE 。 ③Hofstee作图法（略） 把（2）式等号两边乘以 QUOTE ，得： QUOTE (3) 以v对 QUOTE 作图，这时斜率为 QUOTE ，纵截距为 QUOTE ，横截距为 QUOTE 。 ④Hanas作图法（略） 把（2）式等号两边乘以[S],得： QUOTE (4) 以对[s]作图，这时斜率为 QUOTE ，纵截距为 QUOTE 。 （a） (b) 本实验主要以双倒数法，即Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： 然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。 【仪器与试剂】 仪器： 恒温水浴 721型分光光度计 试剂： 酚试剂：称钨酸钠（ QUOTE W QUOTE ·2 QUOTE O）100g，钼酸钠（ QUOTE Mo QUOTE ·2 QUOTE O）25g置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。 2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2?2H2O），溶于1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。 碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。 【实验步骤】 取6支试管按下表加入试剂： 1 2 3 4 5 6 2.5mM磷酸苯二钠（ml） 0.2