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[指南]RNA提取和Northern blot 模块二 总RNA的提取与Northern杂交 一、总RNA的提取 1. 实验目的 核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。RNA是用来在转录水平上研究基因的表达与调控机制的载体，它是基因操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作可以提供良好的保证，RNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术。 RNA的提取对分子生物学的研究至关重要。纯度高、完整性好的RNA可以用于Northern杂交、mRNA纯化、cDNA文库的构建和体外翻译、RT-PCR等。RNA主要存在于细胞质中，约占75,，另外10,在胞核中，15,在细胞器中。RNA主要包括3种:rRNA占80,~85,;tRNA占l0,~15,;mRNA占1,~5,。 本实验以芜菁直根皮为材料，学习植物基因组织总RNA的快速提取。通过本实验使学生学习掌握甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法和技术。 2. 实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂硫氰酸胍，可以溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNAase，所以RNA从细胞中释放出来时不会被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 硫氰酸胍—酚—氯仿法提出RNA:硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性;硫氰酸胍使蛋白质变性，从而释放RNA。 甲醛与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定的碱基配对，这些配对通过阻止链内碱基配对而是RNA维持在变性状态。由于此种配对不稳定且容易被稀释除去，因此只有当甲醛存在于缓冲液或凝胶中时，RNA才能维持在变性状态。 变性消除了二级结构的单链RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。 有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA应当能清楚地在紫外灯下看到，有时能看到一条由tRNA和5SrRNA组成的、较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA亮度的1.5-2.0倍，且这两条带都没有弥散现象。mRNA是不可见的，除非过量上样。 3. 实验设备 移液器，tip头， tip头盒、台式高速离心机，研钵，1.5ml离心管 ，三角瓶，磁力搅拌器，试剂瓶， -80?冰箱，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶 4. 实验试剂 RNA提取液: 0.8mol/L盐酸胍，0.4mol/L硫氢酸铵，0.1mol/L醋酸钠(pH5.0)，5%甘油，38%Tris-饱和酚。 10×MOPS缓冲液(吗啉代丙烷磺酸，2-(N-morpholino )propane sulfonic acid):0.2mol/LMOPS，50mmol/L醋酸钠，10mmol/LEDTA。 RNA上样缓冲液:62.5% 去离子甲酰胺，16% 10×MOPS，22%甲醛。 电泳缓冲液:用无菌水稀释10×MOPS，使终浓度为1×MOPS。 其他试剂:琼脂糖，1mg/ml溴乙锭，溴酚蓝，甲醛，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，75%乙醇，1.2MNaCl，异丙醇，灭菌的ddHO。 2 5. 实验步骤 (1)于1.5ml Eppendorf管中加入1ml RNA抽提液、30μl β-巯基乙醇。 (2)用液氮预冷研钵及三角瓶、钥勺，将直根皮放入预冷研钵后，加入液氮，迅速冷冻后快速研磨至 粉末状。 (3)迅速用钥勺加粉末于抽提液中，剧烈震荡混匀10分钟。 (4)加入350μl氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀5分钟。4?、12000rpm离心15min。 (5)取上清液于一新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀10分钟。4?、12000rpm离心10min。 (6)取上清液于一新管中，加入300μl 1.2M NaCl、等体积异丙醇，混匀室温放置10min。 (7)4?、12000rpm离心10min，弃上清，75%酒精洗沉淀， 4?、12000rpm离心5min。弃上清，空气 干燥10-20 min，加20 μl无菌水溶解沉淀。 (8)用透明胶带将胶板的两端封好。 (9)电泳胶的制备 试剂 用量 琼脂糖(0.8%) 0.16 g 10×MOPS 4.8 ml 水 15.2ml (10)倒胶:在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中(注意不要出现 气泡)，凝胶厚度在3-5 mm之间。 (11)RNA样品变性:在1.5ml灭菌离心管中