医学分子生物学 第四蛋白质及蛋白质组.ppt

当一个基因组的全序列测定之后，确定其含有的ＯＲＦ就成为了主要任务，称为基因注释。目前用于基因注释的方法还有较高的出错率，尤其对于那些存在不连续基因（即在一个基因内插有非编码的核苷酸序列）的复杂基因组，出错的问题更为突出。此外，这些ＯＲＦ是否与蛋白质存在一一对应关系也是一个问题。一方面，人们已经发现有许多“假基因” (pseudogene）的存在，这些假基因有和真基因相同的ＯＲＦ，但却从不表达。另一方面，由于存在ＲＮＡ水平上遗传信息的加工——mRNA 编辑（ＲＮＡ??editing），以及蛋白质水平上遗传信息的加工——蛋白质剪接（protein splicing），许多蛋白质很难找到直接对应的ＯＲＦ。如果我们不能确定基因组的“所有”基因，我们从何知道蛋白质组的“全部”蛋白质？ 显然，确定基因数目最可靠的方法是通过研究蛋白质组来进行。据最新统计，人类基因组拥有的基因数目大约是在３万到４万个之间。如果能够把人体２５２种细胞内的全部蛋白质都给鉴定出来，那么我们就有可能真正知道人类基因组的所有基因。但是这样一来，基因组和蛋白质组形成了“循环定义”：蛋白质组是以基因组拥有的所有基因的表达产物来构成，而所有基因的确定又必须通过蛋白质组来给予肯定。可见，要找出一个生物体基因组的所有基因和相应的全部蛋白质，是一项非常困难的任务。 蛋白质组 ?细胞蛋白质组 ?亚细胞蛋白质组 定量蛋白质组 常用蛋白质分析技术 二维电泳（1975 O’Farell） 荧光染色、核素标记、色谱、质谱、蛋白质芯片技术 双向（二维）凝胶电泳是目前蛋白质组最有效的分离方法，是蛋白质组分离技术的核心。 双向凝胶电泳的第一向是以蛋白质等电点（pI）的差异为基础进行分离的等电聚焦电泳。 第二向是以蛋白质分子量差异为基础进行分离的SDS。 (一)、蛋白质组分离技术 二维电泳的重复性 （ HepG2：18cm IPG Ph 3-10） (二)、二维电泳图象分析技术 二维电泳的结果是满天星斗式的几千个形状各异的斑点，用肉眼寻找其差异以及对蛋白质点的表达量进行比较分析均不可能。 随着计算机图象识别和分析软件技术的发展，双向电泳凝胶图象分析软件已经可以全自动匹配比较任何数目的凝胶图象。 (三)、蛋白质分析鉴定技术 就是对特异蛋白点的氨基酸序列分析。 目前，质谱分析和蛋白质序列分析最受青睐，质谱以其快速、准确、灵敏而成为蛋白质组主要的分析技术。 Nobel Prize in Chemistry 2002 for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules NMR John B. Fenn Koichi Tanaka ESI MALDI b. 1959 b. 1917 质谱 质谱 按照离子的质量对电荷比值(即质荷比)的大小依次排列所构成的图谱，称为质谱。 质谱分析法 利用质谱进行定性、定量分析和结构分析的方法称为质谱分析法。 质谱分析法与其他仪器分析法相比的优点： 1.质谱法是唯一可以确定物质分子质量的方法，且可以确定化合物的化学式和进行结构分析。 2.灵敏度极高，鉴定最小量达10-10g，检出限可达10-14g。 质谱分析法基本原理 质谱法是采用高速电子来撞击气态分子或原子，将电离后的正离子加速导入质量分析器中，然后按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，即得到质谱图。质谱不是波谱，而是物质带电粒子的质量谱。 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 真空系统 记录系统 仪 器 原 理 图 * * * Pauling等人提出了形成稳定肽键的空间结构原则，即： 1、肽键-CO-NH-中的四个原子和与它相邻的两个α-碳原子都处于同一个平面上； 2、肽键中的C-N键（键长0.132nm）比大多数的其他C-N键(键长0.149nm)短，具有部分双键的性质，因此不能自由旋转。 * 因此根据Pauling提出的原则，可以把多肽链的主链看成是由一系列坚硬的平面组成的。平面之间被α-碳原子隔开。主链上有1/3是C-N键，因为它们具有双键性质，不能自由转动。因此，肽键将使得一条多肽链的构象数目受到很大限制。 主链上的Cα-N 和Cα-C键可以旋转，但也不是完全自由的。因为： 第一、这两个键旋转时将受到α-碳原子