氨基酸纸层析法新.docVIP

实验二 氨基酸纸层析法 一、实验目的 1、学习并了解分配层析的原理； 2、掌握纸层析法分离氨基酸的原理和步骤。 二、实验原理 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。 氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 三、药品器材 1实验器材 混合氨基酸溶液（蛋清或血清水解后的氨基酸干粉）6mg/ml、滤纸、烧杯10ml(×1)、剪刀、层析缸（×2）、微量注射器10(×1)或毛细血管、电吹风（×1）、722型（或7220型）分光光度计2实验试剂 (1)溶剂系统 碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(12％氨水):V(95％乙醇)=13:3:3 酸性溶剂：V[正丁醇（A.R.）]:V(80％甲酸):V(水)=15:3:2 (2)显色贮备液:V(0.4mol/茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5。 (3)V(0.1％硫酸铜:V(75％乙醇)=2:38溶液，现配现用。 四、实验方法 滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成24cm×28cm的长方形，在距纸一端2cm处用铅 笔轻轻划一基线，在线上每隔3cm，画一小点样的原点。 点样：用毛细管吸取少量氨基酸样品点于原点(分批点完)，用吹风机稍加吹干后再点 下一次，重复3次，点子直径不能超过0.5cm。 展层：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培养皿 内，不需平衡，立即展层。展层剂为酸性溶剂系统[V(正丁醇)：V(甲酸)：V(水)=15:3:2]，把展层剂混匀 ，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液(每10ml展层剂加0.1-0.5ml的显色贮备液)进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时。 显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现。 结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之 间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf 值，与标准氨基酸的 Rf 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。 五、实验结果 由层析滤纸图可得：溶剂前沿距原点8.57m。 单一氨基酸溶液各自的Rf值 脯氨酸的Rf值=3.37/8.57=0.393 缬氨酸的Rf值=5.31/8.57=0.620 苏氨酸的Rf值=2.45/8.57=0.286 赖氨酸的Rf值=1.30/8.57=0.152 氨基酸混合液中各氨基酸的Rf值 成分1的Rf值=3.51/8.57=0.409 成分2的Rf值=6.00/8.57=0.642 成分3的Rf值=3.29/8.57=0.248 成分4的Rf值=1.69/8.57=0.141 根据混合样品的Rf值与标准氨基酸Rf值的比较可以判断混合样品中成分1为脯氨酸，成分2为缬氨酸，成分3为苏氨酸，成分4为赖氨酸。 七、思考题 纸层析法的原理是什么？ 答：纸层析法又称纸色谱法。以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）。在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析。 何谓Rf值？影响Rf值的主要因素和注意事项？ 答：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离