海人藻酸致痫大鼠心肌细胞ERK表达实验探究.docVIP

海人藻酸致痫大鼠心肌细胞ERK表迖实验探究 ［ ］目的研究海人藻酸致痫大鼠心肌细胞ERK表 达情况。方法采用立体定位仪下杏仁核内注射海人藻酸方 法制备癫痫动物模型，在大鼠癫痫发作后不同时程，快速 制备心脏组织标本，进行免疫组化及染色，用Image_Pro Plus 像分析软件，计算大鼠心肌细胞ERK表迗灰度值的均数和 标准差，观察不同时程心肌细胞E RK表迖情况。结果致癫 痫组大鼠心肌细胞ERK表达于癫痫发作后1/2小时开始增 加，灰度值为4735. 86± 172. 43，2小时心肌组织ERK的表 达迗到高峰，灰度值为127 64.71±178.45，与对照组相比 P值均＜0.05,随后逐渐下降；至癲痫发作6小时，心肌组 织ERK表达基本消失，灰度值为2389. 78±185.64，与对照 组相比P〉0. 05。结论ERK在癫痫所引起的脑心综合征中有 表迗 ［关键词］癫痫；心肌细胞；细胞外信号调节激酶 R54 A 1009_816X (2008) 01_0015_03 引起脑心综合征的原因很多，颞叶癫痫是最常见之一 但国内关于颅内疾患所致的脑心综合征的报导，少有由癫 痫引起脑心综合征的临床报道。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 作为胞内信号转导系统，在海人藻酸(KA)致痫模型中以及 在心血管系统中均有重要意义，然而MAPK在癫痫引发脑心 综合征中是如何发挥作用，尚无公认的定论。有研究报道， 在KA侧脑室内注射致痫模型中，痫性发作l/2h后ERK(细胞 外信号调节激酶)、JNK、p38均升高，ERK持续升高约3h， 而JNK和p38在2h后即恢复正常[1],本文对ERK在癫痫 所引起的脑心综合征中的表达进行探讨。 1材料与方法 1.1主要仪器和试剂：动物大脑立体定位仪 (BUNKY0_KV113T0KY0) _日本;LMS_2B 型二道生理记录仪_ 成都。MAPK1/2 (抗体)及KA购自美国sigma公司。 1.2动物分组：实验动物选用健康雄性Wistar大鼠42 只，体重约250克，均购自吉林大学新民校区实验动物部， 其中正常对照组大鼠7只，致痫组大鼠35只，按海人藻酸 致痫后癲痫发作即刻、1/2小时、2小时、4小时及6小时 分为5组，每组各7只。 1.3模型建立：将KA溶解在PBS中性缓冲液中，配制 成浓度为1毫克/毫升的液体。用10%水合氯醒0. 33ml/kg 体重腹腔麻醉大鼠。将大鼠两外耳道固定于立体定位仪上， 并将水平线调零。取头颅正中菱形切口，暴露颅骨及前囟、 后囟，将立体定位仪正中线调零。右侧杏仁核基底外侧核的 坐标位置为前囟后2. 5mm，旁开5. Omm，烦骨表面下8.0mm。 用小牙钻钻透顶骨至硬脑膜处，一部分动物在KA注射前， 预先在左侧海马CA3区包埋双极电极。按照上述右侧杏仁核 坐标，注入海仁藻酸lul，空白组为生理盐水lul，注药后 留针约5min左右，缓慢退出。然后，缝合切口，将大鼠放 在敞口有机玻璃罩中，按Racine分级法，将大鼠行为分为 以下5级：0级_正常行为状态；I级：湿狗样颤动，面部痉 挛抽动，包括眨眼、动须、节律性咀嚼等；II级：I级加节 律性点头；III级：II级加前肢痉挛；IV级：站立并伴双侧 前肢痉挛；V级：持续站立、倾倒、失平衡、四肢抽动。 达到以下两个条件为模型成功。①按Racine标准分级，大 鼠致痫后出现III级以上发作；②鼠海马深部电极脑电图出 现正常波上棘波和尖波放电。 1.4免疫组化及染色：分别于大鼠癫痫发作后即刻、 l/2h、2h、4h及6h后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，快速取 心脏标本，置于10%中性缓冲福尔马林固定液中1.5小时后， 弃去固定液，准备酒精脱水、石蜡包埋及免疫组化及染色。 切片经HE染色后拍照，在显微镜下放大20倍后再拍照， 每张切片选取10个视野，选定其中某一细胞作为标准，用 Image_ Pro Plus图象分析软件测定心肌组织ERK表达的灰 度值。 1.5统计学处理：所有实验数据用x_±s表示。统计 学分析，各组间比较采用方差分析，成组数据的比较采用t 检验，P0. 05为有统计学意义。 2结果 2.1海人藻酸致痫大鼠的海马深部电极脑电改变 正常大鼠脑电波形，频率以5?10赫兹为主，波幅小于 700Mv,见图1。KA注射后各组大鼠脑电波均出现多种形 式的癫痫性放电。典型波形有单棘波、多相棘波、双相棘波、 棘慢波、尖波发作性节律波、发作后抑制等，见图2。 2.2致癫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表迗的病理学改 变，见图3?7。 2.3致痫组大鼠心肌细胞不同时程ERK表迗的灰度值测 定：见表1。 3讨论 心脏和中枢神经系统相互关联，正常情况下脑通过自主 神经系统调节心脏活动而维持一种稳态，当神经系统发生 病变时会打破这种稳态。 MAP