实验六的基因的PCR扩增.pptVIP

2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。 六、PCR反应条件的优化 3、引物： 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物 之间形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 引物设计原则： 总原则是提高扩增的效率和特异性 六、PCR反应条件的优化 实验六 目的基因的PCR扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 二、实验原理 二、实验原理 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性 （2）引物退火 （3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。 二、实验原理 1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双 链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基 配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分 双链DNA，即退火阶段。 3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单 链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。 5’ 3’ 3’ 5’ 高温变性 低温退火 中温延伸 不断循环 聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图 目的片段 模板 引物对 二、实验原理 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 二、实验原理 二、实验原理 二、实验原理 PCR：变性－退火－延伸 二、实验原理 PCR 二、实验原理 二、实验原理 温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 二、实验原理 二、实验原理 三、实验仪器与试剂 1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移 液器、吸头、电泳设备等。 2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq 酶（5u/μl）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂 糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲 液、溴化乙啶染液、等。 四、实验步骤 1、PCR反应一般在200 ul的PCR薄壁管中进行。 2、反应体系（25 μl） ddH2O 18 ul 10x PCR buffer（Mg2+ +） 2.5 ul 模板DNA 1ul dNTPs（25mM） 1ul 引物1 (10 pmol/ul)