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实验一十七 同功酶遗传标记分析 一、实验目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的技术，了解同工酶分析在遗传学研究中的意义 2.同工酶遗传标记的分析 二、实验原理 同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多种形式是由基因决定的，也即同工酶是基因表达的直接产物。由同一基因座的不同等位基因编码的各种同工酶又称为等位酶，它们从分子水平上反映了等位基因的相对差异。因此，同工酶不仅是一种生理生化指标，而且也是一种可靠的遗传标记。 制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度（100毫升凝胶溶液中含有单体和交联剂总克数）决定。当采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳体系时，一般上层是大孔径的浓缩胶（pH 6.8），下层为小孔径的分离胶（pH 8.9），电泳缓冲液为Tris－甘氨酸缓冲液（pH 8.3）。在这种不连续系统里，存在着电荷效应，分子筛效应和浓缩效应。蛋白质（酶）按其电荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上。用此凝胶板与酶反应底物进行催化反应，再用生物染料染色便形成肉眼可见各种酶带。 三、实验材料 水稻（Oryza　Sativa）：二亲本、 F1、F2四种植株群体的幼苗 四、实验器具和药品 1.用具：电泳仪，电泳槽，注射筒及针头，微量注射器，玻璃板，离心机等。 2.药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）,四甲基乙二胺（TEMED），丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bis），甘氨酸，过硫酸铵，蔗糖，溴酚蓝，联苯胺，过氧化氢。 四、实验步骤 1.种子发芽 取各样品种子100粒，分别置于培养皿内，在30℃之恒温箱中催芽，待芽长出1-2叶，便可进行取样。 2.制备酶粗提液 一般取样0.5克，置于研钵中，加入1.5mL电极液研磨匀浆后，将样品移至小离心管中离心（3500rpm）15分钟，取上清液，电泳前可在冰箱中保存。 3.聚丙烯酰胺凝胶系统的配制 分离胶的配制 浓缩胶的配制 4.点样 取出样品解冻,以微量注射器吸取样品上清液50微升加入样槽内(注意要针头接近槽底慢慢注入,防止扩散),并在玻璃板上贴上样品编号。 5.电泳 电泳槽加电极缓冲液，加一滴0.2%溴酚蓝，接好电源，在4℃冰箱中电泳。 当溴酚蓝迁至凝胶下端0.5-1cm时停止电泳，电泳时间约3-4小时。 6.染色 将完整的胶板，加入染色液，浸泡凝胶，室温下染色20-30分钟，呈现酶带后取出凝胶，用水漂洗终止染色,洗净后可仍浸于清水内(注意经常换水),亦可制成干片永久保存。 7.酶带的比较分析 酶带 六、作业 1.绘出各种样品中酯酶同工酶谱，并说明酶谱差异。 2.分析F2酯酶同工酶标记的遗传分布及其规律。 * *