血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定.docVIP

血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定 一、实验目的 1 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 5.学习柱层析技术 二、实验原理 （一）粗提原理-盐析法 1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。 2.水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 3.蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 （二）脱盐原理-凝胶层析 1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。 2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 （三）纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 （四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 （一）实验材料 1.样品：人混合血清 2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液 器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等 （二）实验方法 1.实验步骤 2.注意事项 上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。 洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入空气。 切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的BaCl2混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。 四、结果与讨论 （一）实验现象1.盐析 1）加入饱和硫酸铵溶液血清变浑浊 2）离心后出现明显的分层现象，上清液黄色透明，沉淀乳白色 2.凝胶柱层析除盐 1）将沉淀溶液加入过葡聚糖凝胶G-25层析柱后，层析柱色透明溶液变浑浊，之后，随着溶液的流出），层析柱上层液体逐渐变清澈黄色。 2）经过缓冲液的洗脱后，将过葡聚糖凝胶G-25层析柱内溶液滴入有磺基水杨酸的黑色反应板空中，出现白色沉淀。 3） 4）用BaCl2检测SO42-没有沉淀（即为阴性）上图3-3 5）将上清液加入过葡聚糖凝胶G-25溶液。 6）用磺基水杨酸检测蛋白质，同样出现白色沉淀。见图3-4 7）接着，收集含有蛋白质的峰液（清蛋白）呈淡淡的黄色透明状。 8）用BaCl2检测没有沉淀（即为阴性） 3．离子交换柱层析纯化 1）收集含有蛋白质的洗脱液3管（球蛋白）呈无色透明。 2）用磺基水杨酸检测蛋白质，未出现明显白色沉淀。 3）连续收集2管含有清蛋白的洗脱液，均为很淡很淡的黄色透明溶液，几乎接近无色。 4．醋酸纤维素薄膜电泳 1）电泳结束后，醋酸纤维素薄膜没有出现现象。 2）将薄膜从染色液中取出，薄膜染上深蓝色。 3）将薄膜漂洗干洗后，深蓝色消失。 4）取出薄膜后，具体情况如下图 由上图可见，本次实验成功显现出了清，球蛋白的条带，然而颜色过浅，色带过于模糊，与下图另一小组所做的结果形成了鲜明的对比。 分析讨论 在脱盐步骤中，收集球蛋白、清蛋白时机太晚，虽然是在磺基水杨酸检测出蛋白质后才收集的，很可能前面已经流走大量蛋白质了 在纯化步骤中，纯化球蛋白时，因为粗心，未等层析柱上的球蛋白溶液下降到凝胶床便加0.02mol/L的NH4Ac，对球蛋白溶液造成了稀释，加之收集的时候太过心切，且磺基水杨酸检测一直无反应，很可能错过了球蛋白流出的峰期，没收集到足够的球蛋白。 回顾反思 纯化球蛋白的时候，是利用清蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白等电点的不同，令前三者吸附在离子交换柱上，用0.0