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汉恒重组腺病毒操作手册 目录 腺病毒安全使用和注意事项 腺病毒储存与稀释的注意事项 一、整体实验流程 二、实验材料 三、腺病毒包装和浓缩 四、重组腺病毒滴度（PFU ）的测定 五、重组腺病毒感染目的细胞 六、重组腺病毒用于动物实验 附 1 ：汉恒生物腺病毒载体 附 2 ：腺病毒感染细胞最佳MOI 的摸索（表达荧光的病毒） 附 3 ：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较 汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册 腺病毒安全使用和注意事项 ➢ 腺病毒安全使用注意事项 （*非常重要！！！* ） 1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。 2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70%乙醇加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。 4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用 84 消毒液浸泡后统一处理。 5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。 6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。 7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。 ➢ 腺病毒储存与稀释的注意事项 1 ）腺病毒的储存 收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃ 保存（一周内使用完最佳）；如 需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。 注： 汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册 a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低 10%~50% ），因此在病毒使用过程中 尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube ），收到后请直接放置-80℃冰箱保存 即可。 b.若病毒储存时间超过 6 个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表 2-慢病毒滴 度测定方法）。 2 ）腺病毒的稀释 需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用 PBS 或培养目的细胞用的无血 清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。 重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域 被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、 原代细胞和部分组织；感染效率高达 100% ，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染； 对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb ）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重 组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。 目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒 5 型（Ad5 ），其基因组是36Kb 长的线性双链 DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber ）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从 内吞体（endosome ）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的 复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。 目前最常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因首 先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复 制基因 E1 和 E3 的缺陷(ΔE1, ΔE3) ，其中E3 基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装 汉恒腺病毒载体构建及包装操作手册 必需依赖表达 E1 的细胞系，例如 HEK-293 ，HEK-293A 等。 相对于 Adeasy 系统，AdMAX 系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作 说明均基于 AdMAX 系统，该系统由 pHBAd 系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体 pBHGlox(delta)E1, 3Cre 双载体组成。 一、整体实验流程 二、实验材料 该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd 系列，包括包括过表达、干 扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1, 3Cre)。 1、载体信息（见附 1 ）