SDS-PAGE蛋白电泳方法.docVIP

SDS 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 Mr 的函数。 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃ 注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收， 其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。 分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存； 堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL， 电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存 2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL 10%SDS溶液 4.0mL 甘油 2.0mL 巯基乙醇 2.0mL 溴酚蓝 0.02g， 混匀后1mL分装，-70℃可贮存 10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存； TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存； 水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。 染色液(100mL)：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒 脱色液(1L)：分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。 其他器材： 容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。 分离胶配方(100mL，4块胶) 贮液 分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%) 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 凝胶贮液(mL) 26.67 30.00 33.33 36.67 40.00 43.33 46.67 50.00 53.33 56.67 60.00 分离胶缓冲液(mL) 25 双蒸水 (mL) 46.53 43.20 39.87 36.53 33.20 29.87 26.53 23.20 19.87 16.53 13.20 10%SDS (mL) 1.0 10%AP (mL) 0.75 TEMED (mL) 0.05 (抽气后添加) 堆积胶配方(40mL，4块胶) 贮液 堆积胶中丙烯酰胺的终浓度(%) 3.0 4.0 5.0 凝胶贮液(mL) 4.00 5.36 6.66 分离胶缓冲液(mL) 10.0 双蒸水(mL) 25.36 24.00 22.70 10%SDS(mL) 0.4 10%AP(mL) 0.2 TEMED(mL) 0.04 (抽气后添加) 操作步