课件：绪论(医学细胞生物学).ppt

二、细胞培养及相关技术 （一）体外细胞培养技术 （二）细胞融合技术 （三）细胞显微操作技术 * 三、细胞及亚细胞组分的分离和纯化技术 （一）细胞化学免疫荧光技术 细胞化学: 在保持细胞结构的基础上，利用某些化学物质可与细胞内某些成分发生化学反应，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物质存在于细胞中的部位。 例如：Feulgen法——显示DNA * 免疫细胞化学（immunocytochemistry）: 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。 抗原：大分子或与大分子相结合的小分子。 抗体：由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。 如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 * （二）细胞显微分光光度测定技术 根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，用以测定这些物质如核酸和蛋白质等生物大分子在细胞内的含量。 吸收光谱的波长： 230 ～ 700nm Feulgen染色后的DNA吸收的波长：546nm 细胞显微分光光度测定技术：定位和定量 * （三）流式细胞计量术（FCM） 用氩离子激光发出的激光束为激发光，通过调节液压，迫使悬浮的细胞排成单列，按重力方向流动，当细胞通过激光束检测区时，细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光，若经荧光染色的细胞，就会发出一定强度的荧光，仪器的检测系统，就可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定，并将光信号转变成电信号，由电子控制台放大和显示。 * 测量速度：5 000个细胞/s＋ 8个相关参数 分选出细胞纯度：90～99% 检测的参数：细胞大小、体积、DNA、RNA、总蛋白含量、表面抗原、受体、染色体等 应用：细胞动力学、免疫学、体细胞学、肿瘤的诊断和治疗等。 流式细胞仪特点 * * * * （四）放射自显影术 （五）细胞器的分离与提纯技术 * 四、细胞分子生物学技术 （一）细胞原位分子杂交技术 分子杂交的基本原理：碱基的互补配对 原位杂交（in situ hybridization）： 将细胞或组织切片固定在载玻片上，保持细胞中的 DNA和RNA在原位置条件下，与标记的 DNA或RNA分子探针进行原位杂交，通过放射性自显影或显微镜可探测到待查材料中被杂交的分子。直接进行基因定位、定量分析。 * 原位杂交的特点:杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位即指标本上DNA原位变性，在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置，从而进行准确的基因定位。 原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行，而在未知致病基因时，则无法进行基因定位。 * 荧光原位杂交 （florescence in situ hybridization, FISH） 是一种非放射性原位杂交方法。用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，对检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否最为有效。探针不是放射性的而是将荧光染料与抗体蛋白结合进行检测。它们具有高度亲和力，有与放射性探针相同或更高的分辩率。 * 固定生物样本并准备显微镜涂片 预先调节显微镜 标记探针 对目标DNA进行变性 进行原位杂交和杂交后洗涤 免疫细胞化学染色 显微镜观察 荧光原位杂交（FISH）实验程序 （是一种多步骤的实验方法） * 现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。 1992年运用这种策略已能在中期染色体和间期细胞同时检测7个探针。科学家们的目标是实现24种不同颜色来观察22条常染色体和X、Y染色体。 * 9 12 t(9q/12q) t(9p/12p) 利用FISH技术检测染色体易位 * * DNA探针技术 1.是以已知DNA片段作为探针与待测样品DNA或其片段进行核酸分子杂交，判断二者同源性程度。 2.根据杂交结果就可以分析待测DNA中有无该基因或该基因是否发生了变化，从而作出诊断。 3.DNA探针（基因探针）是一段与目的基因相互补的核酸序列（DNA或RNA），其长度不一，可为完整基因亦可为其一部分。 4.探针：单链，带有容易被追踪和检测出来的标记。 5.寡核苷酸探针：单碱基改变的检测。 * 目前可孕前诊断的单基因病 Prader-Willi综合征(PWS)、性畸形(SRY基因诊断)、X染色体连锁鱼鳞病、Duchenne肌营养不良（DMD）、脆性X染色体综合症、α地中海贫血、