高变区1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2诱生交叉中和抗体-微生物学专业论文.docxVIP

高变区 高变区 1 抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白 E2 诱生交叉中和抗体 第二军医大 第二军医大学博士学位论文 - - PAGE 11 - - - PAGE 10 - 摘 要 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）属于黄病毒科，主要经血液传播，是引 起人类丙型肝炎的病原体。全球约有 1.7 亿人感染 HCV，每年新增感染者达 300 万 -400 万。我国 HCV 感染者估计近 4000 万。HCV 感染易慢性化，其慢性化率可高达 85%，部分慢性丙型肝炎患者可发展为肝硬化，甚至肝细胞癌。目前主要采用聚乙 二醇干扰素 α 联合利巴韦林治疗丙型肝炎，其效果明显受 HCV 基因型影响。2、3 型 HCV 感染对该疗法的持续病毒学应答率（SVR）可达到 75%，但 1 型 HCV 感染 的 SVR 不到 50%。目前全球范围内经血液以及血制品途径感染的丙型肝炎病例与上 世纪九十年代以前相比有大幅下降，但在发展中国家血液和血制品仍然是传播 HCV 的重要途径。此外，每年散发性以及传播途径不明的丙型肝炎新发病例仍高居不 下。控制 HCV 感染的关键措施还是依赖于开发出有效的疫苗，从 1989 年 HCV 基因 组被克隆以来，丙型肝炎疫苗的研究在欧美和日本等发达国家一直是研究热点，但 迄今未有有效的疫苗问世。 HCV 包膜蛋白 E2 位于 HCV 蛋白前体第 384-746 位氨基酸残基，由一个大的 N 端膜外区和一个 C 端疏水锚定区组成，与 HCV 另一包膜蛋白 E1 通过非共价键形成 异源性二聚体。E2 蛋白是介导病毒吸附和进入宿主细胞的关键蛋白，是诱导宿主产 生 HCV 中和抗体的关键抗原，因此是疫苗研究的最主要靶标。然而，包膜蛋白高度 变异，尤其 E2 蛋白氨基末端的含有 27 个氨基酸残基的高变区 1（hypervariable region 1，HVR1）是 HCV 蛋白中变异频率最高的区域，也是公认的 HCV 中和抗体表位所 在区域。HVR1 是介导 HCV 与受体 SR-BI 结合的关键区域，HVR1 与 SR-BI 的作用 通过几种不同的机制促进 HCV 细胞侵入。HVR1 抗体和 SR-BI 抗体均能阻断 HCV 感染。HVR1 的高度变异曾被认为是遏制丙肝疫苗发展的瓶颈问题，近几年来基于 HCV 假病毒（HCVpp）以及细胞培养产生的 HCV（HCVcc）的中和试验发现，HVR1 并不是唯一的中和抗体表位所在区域，在 HCV 包膜 E2 蛋白中还存在一系列构象依 赖的中和表位和线性中和表位，其中一些表位在不同基因型、亚型间高度保守。 本实验室前期分别用分泌表达 E2 的表达质粒以及删除了 HVR1 的 E2 表达质粒 免疫小鼠，然后检测、分析小鼠血清中的抗体以及病毒中和活性，结果显示：E2 质 粒免疫的小鼠血清中，HVR1 抗体在总 E2 抗体中占很大比重，针对 HVR1 以外区域 的抗体在中 E2 抗体中只占较小比重；删除 HVR1 可显著增强 E2 质粒免疫诱导的针 对 HVR1 以外区域的抗体，小鼠免疫血清与其他基因型 E2 蛋白的交叉反应以及对其 他基因型 HCVpp 的交叉中和活性也随之显著增强。这和急性 HCV 感染者血清中可 检测到 HVR1 抗体而难以检测到 E2 抗体相似。结果提示：HVR1 有可能抑制 E2 蛋 白中保守表位的免疫原性，从而从另一个方面导致 HCV 免疫逃避。目前基于 HCV 包膜蛋白为主要靶抗原的疫苗均含有 HVR1，这类疫苗免疫黑猩猩只能抵抗同株病毒 攻击，但不能抵抗异株的攻击。HVR1 的存在可能是这类疫苗免疫保护效果不理想的 重要原因，删除 HVR1 也许能增强疫苗免疫对异株病毒攻击的保护效果。 核酸疫苗在大动物的免疫效果远远不及在小动物的免疫效果，目前还没有核酸疫 苗用于人类。为了进一步探讨用删除了 HVR1 的包膜 E2 蛋白作为 HCV 疫苗的发展 前景，本研究用 CHO 细胞表达了 E2 以及删除了 HVR1 的 E2 蛋白，用亲和层析纯化 出了两种 E2 蛋白，分析两种 E2 蛋白的构象、受体结合功能和抗原性，通过小动物 免疫分析 HVR1 对 E2 蛋白免疫原性的影响，与我们用核酸免疫获得的结果进行对比 和验证，探讨缺失 HVR1 的 E2 蛋白在丙肝疫苗中的应用前景。 一、稳定表达 HCV 包膜 E2-人 IgG Fc 融合蛋白的 CHO 细胞株的建立 我们首先分别拼接 HCV 包膜蛋白 E2-Fc 和 E2Δ-Fc 融合基因（E2Δ 指缺失 HVR1），使 E2 与人 IgG Fc 段作为融合蛋白表达，方便目的蛋白的亲和层析纯化。将 融合基因插入具有自主知识产权的 CHO 细胞表达质粒载体 pCIDA-GS-neo（专利号：