基因工程基本原理及技术.ppt

*   基因工程 基本原理 及技术 基因克隆(gene cloning )：是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增（也包括目的基因的无细胞扩增-PCR）的技术。基因表达(gene expression)：是基因的转录、转译过程，也就是遗传信息从核酸到蛋白质的传递和实现。 基因工程（gene engineering） 或称重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指将获取的目的基因片段在体外与载体DNA通过人工剪切、编接构成DNA重组体，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程. 基因工程基本步骤?目的DNA 制备；载体DNA选择↓DNA体外重组技术 ↓ （ DNA酶切实验、 连接实验）重组DNA的转化（转染）试验↓ 重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，指纹图谱法， PCR方法，探针杂交法 ） ↓ 目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法－Western印杂交法，微细胞法(microcell method) 图l 基因工程操作流程 一.基因克隆( 一) “工程原料”的获取 -获取目的基因 基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。获取目的基因 有三个途径：1.从生物基因组中分离纯化（鸟枪法－shotgun）：原核细胞DNA遗传背景不清。组建基因文库→ 检测鉴定。  2.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。 用于结构清楚、分子量较小的基因 3.酶促合成法-反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因. mRNA→逆转录→ cDNA做目的基因 。可PCR法合成。 Principle of PCR DNA polymerase use single strand DNA as template to synthesize new DNA in vitro,(dNTP;Buffer;Mg2+,Primers) Chain reaction: Repeated cycles of reaction under the same condition. The PCR reaction Anneal Primers 45-68oC template Primers, dNTPs, Taq polymerase, Mg2+ Extend Primers 72oC Denature 95oC What do we achieve by cycling temperature in the presence primers, dNTP, Taq polymerase? Round 1 Anneal primers Extend primers The exponential amplification of the gene in PCR The first 4 cycles of a PCR reaction in detail. In the 3rd cycle two double strands of the right length are copied(the forward and reverse strand are the same in length).In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are copied. Optimum condition of PCR Correct sources of template DNA Best temperature select in three steps Appropriate primers in both end Others: Mg2+; Inhibitor……et al. Primer Design Is Vital Primers should usually be 18-25 bases long Need as much sequence information as possible outside target 3’ end of primer is most importan