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Aβ310疫苗免疫对3月龄AD基因模型鼠APPSWEPS1的预防保护研究
优秀毕业论文
精品参考文献资料
·中文论著摘要·
Ap3—10疫苗免疫对3月龄AD转基因模型鼠
APPSWE/PSl的预防保护研究
目 的
阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年人常见的神经系统变性疾病, 主要临床表现为进行性记忆障碍和智能减退。本病的主要病理特点为老年斑、神 经原纤维缠结和神经元丢失。越来越多的证据表明,D淀粉样蛋白 (amyloid-lBprotein,AB)是AD的共同通路,是AD形成和发展的关键因素,是 构成老年斑的主要成分。目前治疗主要是对症为主,尚无有效的治疗手段。在分 子生物学迅速发展的基础上开始形成了一种新的疗法一基因免疫法。基因免疫治
疗是通过基因编码的蛋白在动物自身的表达诱导免疫反应,产生对抗疾病有关的 特异性蛋白的方法,具有高度的特异性和可选择性特点。己通过动物模型和人体 实验研究表明,基因疫苗可以减少或清除913。我们实验选用AD3.10片??重组构 建基因表达质粒pcDNA3.I+-Ap(3—10)10一CpG,并在真核细胞中转染,探讨其 是否可以在真核细胞中表达;随后在AD的3月龄转基因模型鼠APPSWE/PSl进 行免疫治疗,观察其行为学改善,可以形成抗A肛2特异性抗体,减轻Ap沉积及 AB斑,说明了该疫苗对3月龄转基因模型鼠APPSWE/PSl有预防保护作用;同
时没有脑内炎症反应发生,在重要脏器中无病理改变,说明该疫苗的安全性。本 实验证明该疫苗是一种安全有效疫苗,为进一步的临床试验治疗提供了参考依据。 材料与方法
l、pcDNA3.1+.A13(3.10)10.CpG重组质粒载体构建
用PCR扩增A B 3—10片段lO次,克隆CpG序列插入上述片段,从而获得目的
f
基因A B(3—10)10-CpG,再把A 13(3—10)10-cpG基因克隆入pcDNA3.1质粒载
体,构建重组pcDNA3.1+--^B(3—10)10-CpG载体,双酶切鉴定构建质粒。
2、动物分组与免疫方法
15只3月龄APPSWE/PSl鼠,由中国医科大学实验动物中心提供,随机分成3 组:对照组(n=5)、A B卜42组(n=5)和A D 3—10组(n=5)。A 13 3-10组在接种前一 天用布比卡因处理,首次分别取AB卜42疫苗、AB 3一i0疫苗及PBS液100 ug/ 只,肌肉注射相应组鼠左侧股四头肌,2周后予加强接种1次,以后每4周加强 接种1次,共进行9个月。
3、空间学习记忆能力检测
最后1次接种后l周用Morris水迷宫检查鼠空间学习记忆能力,前4天定位 航行测试的8个Block的训练,实验观察和记录鼠寻找并爬上平台的路线图及所 需时间,即记录其逃避潜伏期和游泳速度。空间探索用于测量学会寻找平台后, 对平台空间位置记忆的保持能力。记录目标象限的游泳距离占总游泳距离的百分 比,判断其学习和记忆的能力。排除游泳速度所致的差距。
4、鼠处死取标本
每次免疫后2周取血,分装一70℃冻存。在109/L戊巴比妥钠腹腔麻醉下, 从左心室快速灌注生理盐水100ml,迅速分离脑、脾脏、肝脏、肺脏和两侧肾脏, 称其湿重量,脑组织匀浆,脾细胞增殖培养,余标本409/L多聚甲醛固定。用ELISA 检测抗体水平及IFN—Y、IL-10,酶标仪测各孔值并计算分析。
5、Western Blot检测重组质粒载体pcDNA3.1+—-A B(3.10)
10.CpG构建及体外表达
蛋白提取后,取等量样品进行聚丙烯凝胶电泳,经一抗、二抗孵育并显色, 照像及分析。 .
6、免疫组织化学染色观察淀粉斑的沉积
石蜡切片常规二甲苯脱蜡梯度酒精水化,分别加入一抗、二抗孵育染色,显
色染色切片镜下照像并分析。
7、HE染色观察重要脏器的改变
石腊包埋切片,常规HE染色,肾组织块六胺银染色(MSSG)观察基底膜。光 镜下观察并照像。’
2
8、统计学分析
所有原始数据采用SPSSl 1.0分析软件进行处理分析,所有结果均表示为均数
±标准差,样本均数比较采用单因素方差分析方法,正态分布及方差齐时,两两 比较用LSD检验;非正态分布采用秩和检验,PO.05有显著性差异。
实验结果
1、Morris水迷宫结果
A 6卜42组、A B 3—10组APPSWE/PSI鼠逃避潜伏期较对照组时间少,有显著 性差异(P0.05),表明经训练后寻找平台的时间均缩短。空间探索试验显示A 13卜42组和A旦3—10组游泳轨迹主要是以中央型为主,围绕平台周围的轨迹较多, 而对照组则主要是边缘型为主;在目标象限游泳距离百分比较对照组显著增高, 并不受游泳速度影响。
2、Western Blot检测重组质粒载体pcDNA3.1+—_A 13(3.10)
10.CpG构建及体外表达
成功构建重组质粒载体pcDNA3.1+
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