AIM2对肝细胞肝癌的作用效应分子机制-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文 CATALOGUE Chinese Abstract 1 English Abstract ．8 Symbolic Description 1 3 Introduction 14 Meterial and methods l 7 Results ．．32 Discussion ．．39 Conclusion ．43 Figures ．．44 Tables 56 References ．．59 Review ． ．63 Acknowlegement 71 publications 72 万方数据  山东大学硕士学位论文 AIM2对肝细胞肝癌的作用效应及分子机制 专业：生物化学与分子生物学 研究生：马小敏 导师：韩丽辉教授 中文摘要 研究目的 肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内第五大常见癌症， 其致死率居第三位，全球每年约50万人死于HCC。其主要致病因素是乙型及丙 型肝炎病毒感染，此外长期酗酒、黄曲霉素感染、脂肪肝等因素也会导致肝癌的 发生。HCC发生与进展的分子机制目???尚未完全阐明，因此对其进行深入探索 将为从分子水平对肝癌进行早期预防和干预奠定基础。 AIM2(Absent in melanoma 2)是干扰素诱导的HIN．200蛋白家族中的一员， 其作为一种胞内DNA感受器，在固有免疫中发挥重要作用，近年来的研究显示， AIM2也能够影响肿瘤的发生与进展。AIM2对肝细胞肝癌的进展是否发挥效应 及其作用机制目前尚不明确。本课题深入研究了AIM2在对肝细胞肝癌进展过程 中的作用效应，并初步探讨了其分子机制。该研究证实AIM2表达缺失通过激活 mTOR-S6K1信号通路促进肝细胞肝癌的进展，为肝细胞肝癌的分子靶向治疗提 供了新思路。 材料和方法 1．肝细胞肝癌组织及其配对非癌肝组织中AIM2表达情况监测 1．1免疫组化染色 应用49例肝癌及其对应的远端非癌肝组织的石蜡切片，对AIM2分子进行 免疫组织化学染色，检测其在肝癌细胞中的表达定位与表达水平。 1．2 Western blot检测 万方数据  山东大学硕士学位论文 应用Western blot的方法检测64例肝癌患者的肝癌组织及其配对非癌肝组织 中AIM2蛋白的表达水平。应用Image J软件对肝癌组织及其对应的非癌肝组织 中AIM2表达条带进行定量分析，并应用Graph Pad Prism5．0软件对条带灰度进 行统计学分析。 1．3 Real．time PCR检测 应用Real．time PCR检测64例肝癌组织及其配对非癌肝组织中AIM2 mRNA 的表达水平，并进行统计学分析。 2．AIM2对肝癌细胞生物学活性的影响 2．1肝癌细胞系的筛选 应用Western blot的方法检测HepG2、HUH7、BEL7402、SMCC7721、 MHCC97H和MHCC97L六种肝癌细胞系中AIM2的相对表达量。 2．2 AIM2过表达细胞模型的构建 向SMCC7721和HUH7肝癌细胞系中转染AIM2表达质粒，并以空白载体 转染组作为对照，转染24h后，应用Western blot的方法在蛋白水平验证AIM2 是否高表达，以此判定AIM2过表达细胞模型构建是否成功。 2．3检测过表达AIM2对肝癌细胞增殖，克隆形成和迁移侵袭能力的影响 在成功构建的AIM2过表达的细胞模型中，应用CCK．8、克隆形成实验和 Transwell实验分别检测AIM2过表达对肝癌细胞增殖、克隆形成能力和侵袭转 移能力的影响。 2．4 AIM2表达受抑制的细胞模型的构建 2．4．1 AIM2特异性Si．RNA的筛选 向肝癌细胞系中分别转染合成的三条靶向AIM2的小干扰RNA(Si．AIM2)， 并以非特异性无义序列(Si-NC)转染组作为对照，筛选出两条干扰效率达80％ 以上的Si．AIM2，，用于构建AIM2表达受抑制的细胞模型。 2．4．2 AIM2表达受抑制的细胞模型的构建 向BEL7420和HepG2肝癌细胞系中分别转染Si．AIM2以干扰AIM2的表达， 并以Si．NC转染组作为对照。应用Western blot在蛋白水平验证是否有效干扰 AIM2的表达，以此判定AIM2表达受抑制的细胞模型是否构建成功。 2．5 AIM2表达受抑制对肝癌细胞生物学活性的影晌 万方数据  山东大学硕士学位论文 在成功构建的AIM2表达受抑制的细胞模型中，通过CCK．8法和克隆形成 实验检测干扰AIM2表达对肝癌细胞增殖和克隆形成能力的影响；通过Transwell 实验，检测干扰AIM2表达对肝癌细胞迁移和侵袭转移能力的影响。 3．AIM2炎症小体激活的相关检测 3．1在AIM2过表达的细胞模型和A