LCH7749944抑制胃癌细胞增殖和侵袭机制的分析.docxVIP

·中文论著摘要·LCH．7749944抑制人胃癌细胞增殖和侵袭机制的研究 ·中文论著摘要· LCH．7749944抑制人胃癌细胞增殖和侵袭机制的研究 目 的 肿瘤是严重威胁人类健康的重要疾病。胃癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡 率在世界范围内高居第二，在我国则居于第一位。对肿瘤的发病机制及其诊断治 疗的研究是目前肿瘤研究领域的重要课题。最近的研究表明，肿瘤细胞信号转导 通路的异常是导致肿瘤早期发生和晚期侵袭转移的主要原因。2004年底Nature Reviews Cancer和Nature Reviews Drug Discovery联合论述了激酶信号通路在 肿瘤中的作用，将激酶信号通路确定为肿瘤治疗的靶点，成为未来抗肿瘤药物的 一项研发策略。 p21活化激酶(p21一activated kinases，PAKs)，为一类进化上保守的丝氨 酸／苏氨酸蛋白激酶，目前被认为是肿瘤细胞内信号网络的关键调节因子。PAKs 作为小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白，可被生长因子及其他胞外信号活化，并通 过众多的下游结合蛋白或激酶底物，调节控制许多生物学功能，如：细胞骨架重 组、细胞凋亡、有丝分裂等，特别是在细胞的恶性转化和肿瘤细胞侵袭转移过程 中具有重要作用，因此成为肿瘤治疗新的靶点。迄今为止PAK家族共发现6个成 员，根据其结构及生化特性，将它们分为两类，I类包括PAKl．3，II类包括PAK4．6。 PAK4是目前研究得最为深入的II类PAl(成员，在细胞的生长、生存、增殖及迁 移侵袭中发挥重要作用，其过度表达、基因扩增、基因突变广泛存在予多种肿瘤 中。由于PAK4与肿瘤的发生发展密切相关，已被确认为潜在的肿瘤治疗新靶点。 目前国际上针对该靶点抑制剂的研究尚处于起步阶段。 本研究通过Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的 多种小分子化合物进行高通量筛选，获得PAK4小分子抑制剂LCH．7749944。验 证其对PAK4激酶活性的抑制作用，研究该小分子抑制剂对胃癌细胞生物学功能 的影响，并深入探讨其作用机制，为PAK4靶向抑制剂的开发及胃癌治疗新策略 的研究提供依据。方法 的研究提供依据。 方法 一、PAK4小分子抑制剂的筛选以及LCH．7749944对PAK4激酶 活性抑制作用的验证 l、用Kinase Glo激酶发光检测方法对计算机辅助设计的针对PAK4的多种小 分子化合物进行高通量筛选，获得具有活性的小分子化合物。 2、激酶分析实验检测LCH．7749944在体内外对PAK4激酶活性的影响。 3、激酶分析实验检测LCH．7749944在体外对PAK家族其他成员激酶活性的 影响。 4、Kinase Glo激酶发光实验检测LCH．7749944经结构改造修饰得到的多种衍 生物对PAK4激酶活性的影响。 二、LCH．7749944抑制胃癌细胞增殖、侵袭及机制的研究 l、MTT实验检测LCH．7749944对人胃癌细胞增殖的影响。 2、流式细胞术检测LCH一7749944对胃癌细胞细胞周期的影响。 3、Western Blot及Real time-PCR方法检测LCH．7749944对细胞周期相关蛋 白cyclinDl蛋白及mRNA水平表达情况的影响。 4、Transwell实验检测LCH．7749944对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响。 5、共焦激光扫描显微镜观察LCH．7749944对细胞骨架的影响。 6、Western Blot检测LCH．7749944对HGF下游c．Met．PAK4．LIMKl．cofilin 信号通路的影响。 7、Western Blot检测LCH．7749944对PAK4．MEK．ERKl／2．MMP2及PAK4． c．Src．EGFR．cyclin D1信号通路的影响。 8、计算机模拟小分子化合物LCH．7749944与PAK4、c．Met蛋白分子的对接 情况，并比较化合物LCH．7749944及其衍生物WYA．3与PAK4蛋白的作用方式。 2 结果 结果 一、PAK4小分子抑制剂的筛选以及LCH．7749944对PAK4激酶 活性抑制作用的验证 l、通过Kinase Glo激酶发光方法筛选得到LCH．7749944等多个能够影响 PAK4激酶活性的小分子化合物，从中选择对PAK4抑制作用比较明显的 LCH．7749944作为研究对象。 2、LCH．7749944在体内外均能够以剂量依赖的方式抑制PAK4的激酶活性。 3、LCH一7749944在体外对于PAKl、PAK5的激酶活性均有一定程度的抑制 作用，但其抑制效能均明显低于对心的抑制效能；而对于PAK6的激酶活性 未见明显影响。 4、目前得到的LCH-7749944衍生物中未发现能够更高效抑制心活性的 化合物。 二、L