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包含体内重组蛋白质的复性 　　《生命的化学》2001年21卷4期 　　文章编号:100021336(2001)0420315204　　 　　—315— 　　包含体内重组蛋白质的复性 　　吴丽金　陈宇光 　　(上海大学生命科学学院,上海200436) 　　关键词:大肠杆菌;包含体;重组蛋白;复性 　　中图分类号:Q51 　　制[1]。受欢迎的表达系统,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种 　　具有临床、工业生产21 　　),女,在读硕士。作者简介:1978— 　　种抗体克隆,并证明它比扫描噬菌体抗体库更灵敏。这个技术还可以用来检测蛋白质与小分子的相互作用,包括酶与底物的相互作用。它已经商品化,并与MS结合运用。另一个是发展了微流动装置,以分析蛋白质。微量化的设计减少了被分析材料的用量,还可以发展低成本的一次性芯片。本技术还没有至臻完善。将它与MS、毛细管电泳、荧光检测等结合可望有更大的前景。 　　第二个是同位素译码的亲和标签技术。鉴于现在使用的蛋白质组分析工具难以定量,有人发展了分子量小的试剂,即同位素译码的亲和标签。它可以精确地测量出两个不同生物样品之间蛋白质含量的变化。这些试剂中含有生物素成分,可以用亲和结合方法纯化被标记的蛋白质;它还有一个连接成分,稳定性同位素参入其中;以及一个专一性地与巯基反应的基团。它们有重的和轻的两个版本,二者相差8个质量单位。来自两个不 　　同生物样品的含有半胱氨酸的蛋白质或肽可以被两个版本有差别地标记。经过亲和纯化后,用液相色谱MS,测量出两个不同样品中肽的相对丰度。再用串联MS可以知道蛋白质的特性。这个方法有点类似于用微列阵比较来自不同样品的mRNA浓度谱的差异。本 　　方法在分析很低丰度的蛋白质,和很大的蛋白质时还有一些问题。但是,在确定蛋白质产量,和测量生长在半乳糖和乙醇中的酵母的基因表达变化时,它不失为有很大改进的技术。 　　第三个是分子扫描仪。标准的2DE2MS蛋白质组分析方法受限制于2DE的通量。特别是无法平行地分析大量样品。需要个别地纯化样品,再用MS分析。分子扫描仪可以使消化蛋白质和将产物转移到PVDF膜上这些步骤同时进行,然后,直接用特种MS扫描,得出肽质量指纹图谱。这些数据可以充分地诠释2DE图谱。尽管这个仪器立足于2DE技术,而2DE难以有效地分辨疏水蛋白 　　质,但是,已经用它从人血浆和从大肠杆菌中得到蛋白质组的信息。 　　蛋白质组学的研究成果已经在生物技术领域广泛应用,例如发现了一些能作为疾病治疗靶点的生物化学通路;监测生产过程以控制质量;发展了新的制造生物材料的方法和发展了诊断临床疾病和判断治疗战略效率的测试方法等。可以相信,随着技术和方法不断创新与发展,对蛋白质组的认识,以及将这个研究与基因组研究有机结合,人们对生命奥妙的了解将会达到一个全新的高度! 　　—316—《生命的化学》2001年21卷4期 　　变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的 　　95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构(天然结构),它们在水溶液中通常不溶解且没有活性,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白质的重大损失[2]。所以必须有一个简单而有效的复性策略和方法从包含体中获得具有生物活性的重组蛋白质。1.包含体的分离、洗涤、溶解 　　,械磨碎法、,含体。[1]。为了除去包含体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,应用洗涤液洗涤包含体。洗涤液通常用去污剂Triton2100、脱氧胆酸、蔗糖、尿素、盐酸胍等配制。但必须注意过高浓度的尿素或盐酸胍会使包含体溶解。经过洗涤后包含体的纯度一般可达到90%。洗涤、纯化后的包含体必须用强变性剂6mol/L盐酸胍或8mol/L尿素使其溶解。但通常都是用盐酸胍,这主要有两个原因:一是因为盐酸胍是一种相对更强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包含体溶解。二是因为尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性pH值下长期保温时。例如用盐酸胍溶解人IL24包含体能提高它的复性率,而用尿素溶解则得不到有活性的蛋白质。如果是含有半胱氨酸的蛋白质,那么包含体中就含有分子內和分子间二硫键,这时应添加还原剂二硫苏糖醇(DTT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、二硫赤藓糖醇、半胱 　　ββ氨酸、胱胺、2巯基乙醇(2MT)等使二硫键通过硫醇-二硫化物交换而还原[3]。常用的是βDTT、2MT。DTT的还原能力比β2MT强,因此DTT的用量一般比β2MT少[4]。包含体的溶解、还原方法与它的天然构象中含有的二硫键的数目之间没有明显关系[1]。Fischer等[4]比较了多种溶解包含体的实验方案。2.重组蛋白质的复性 　　为了得到具有天然构象的蛋白质和产生 　　正确配对的二硫键,必须去掉过量的变性剂