高表达精胺精脒 N1 乙酰转移酶对 A549肺癌细胞的增殖和药物敏感性的作用-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

三峡大学硕士学位论文 三 峡 大 学 硕 士 学 位 论 文 I I 3 3 三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明 确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： 三峡大学研究生知识产权承诺书 本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究 工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。 本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部 或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊 发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位， 并事先征得导师或学校相关部门的同意。 我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。 学位论文作者签名： 日 期： II II 4 4 内 容 摘 要 目的：多胺为肿瘤细胞快速增殖所必须，而精胺/精脒-N1-乙酰基转移酶（spermine/ spermidine N1-acetyltransferase, SSAT）是多胺分解代谢途径中的第一个限速酶。为探 讨 SSAT 作为抗肺癌分子靶点的潜在应用价值，本实验中我们首先构建高表达 hSSAT 的 A549 细胞株，然后研究 hSSAT 高表达对人肺癌 A549 细胞的生长增殖、和对抗肿 瘤药物米托蒽醌敏感性的影响。 方法：(1) 以 pCR2.1/hSSAT 质粒为模板，HindⅢ/XhoⅠ双酶切法获得人 SSAT 基 因 编 码 区 ， 将 其 克 隆 入 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1(+)， 构 建 真 核 表 达 重 组 质 粒 pcDNA3.1(+)/hSSAT。用 pcDNA3.1(+)/hSSAT 质粒转染 A549 细胞，筛选获得稳定高 表达 hSSAT 的细胞株。(2) MTT 法检测高表达 hSSAT 对肺癌 A549 细胞生长增殖的 影响；流式细胞术检测高表达 hSSAT 对 A549 细胞周期的影响；划痕法检测高表达 hSSAT 对 A549 细胞迁移的影响。(3) MTT 法、DNA 片段化分析、流式细胞术、线粒 体膜电位分析检测高表达 hSSAT 的 A549 细胞对抗癌药物米托蒽醌敏感性的影响。 结果：（1）成功构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)/hSSAT，并成功获得高表达 hSSAT 的 A549 肺癌细胞株；（2）稳定高表达 SSAT 细胞株的增殖活性在所有测定时间点上 （24h、48h、72h）均显著性降低；与对照细胞相比，高表达 SSAT 的细胞株 S 期细 胞减少，而细胞凋亡率显著增加；划痕法检测发现，A549/pcDNA3.1(+)对照细胞株在 24h 后划痕基本消失，而 A549/hSSAT 细胞株直到 48h 仍未愈合。（3）以 0μmol?L－1、 0.04μmol?L－1、0.08μmol?L－1、0.16μmol?L－1、0.32μmol ?L－1 和 0.64μmol?L－1 共 6 个浓 度的米托蒽醌处理对照细胞和 A549/hSSAT 细胞，MTT 法检测细胞生长情况。结果 显示，米托蒽醌对人肺癌细胞株 A549 有增殖抑制作用，但 A549/hSSAT 对米托蒽醌 更加敏感；流式细胞术检测发现，经 0.04μmol?L－1 的米托蒽醌处理 24h 后，A549 细 胞发生凋亡，高表达 hSSAT 的细胞株凋亡率更高；DNA 片段化检测结果和上述类似， 经 0.04μmol?L－1 的米托蒽醌处理 24h 后 A549/hSSAT 细胞株 DNA 片段化现象更为明 显；米托蒽醌能显著降低 A549 细胞的线粒体膜电位，而 SSAT 高表达的 A549 细胞 相对于对照细胞降低更加显著。 结论：稳定高表达 hSSAT 可在 A549 肺癌细胞中部分模拟多胺类似物类抗癌药 Ⅲ Ⅲ 5 5 物的药理活性，导致瘤细胞生长抑制和细胞凋亡，并且增加了细胞对经典抗癌药米托 蒽醌的敏感性。上述研究提示 SSAT 有作为肺癌治疗分子靶点的潜在应用价值。 关键词：精胺/精脒-N1-乙酰基转移酶; 肺癌; 药物靶点; 多胺代谢 Ⅳ Ⅳ 6 6 Abstract Objective The polyamines are absolutly required for quick cell growth and SSAT (spermidine/spermine N1-acetyltransferase) is the first