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D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究 　　D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究 第45卷第6期 　　2006年11月 　　厦门大学(自然科学版) 　　JournalofXiamenUniversity(NaturalScience) 　　V0L45No.6 　　NOV.2006 　　菜青虫N一乙酰一』3一D一氨基葡萄糖苷酶 　　活性必需基团的研究 　　石艳,刘炜风,陈清西 　　(厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞212程教育部重点实验室,福建厦门361005) 　　摘要:从菜青虫表皮分离纯化N一乙酰一p—D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),获得电泳单一纯的酶制剂,通过化学修饰法研究该 　　酶的活性必需基团.分别以碳化二亚胺(EDC),N一溴代琥珀酰亚胺(NBS),对一氯汞苯甲酸(pCMB),二硫苏糖醇(DTT),澳 　　代乙酸(BrAc)和乙酰丙酮在特定条件下对该酶进行特异的化学修饰,结果表明酸性氨基酸的侧链羧基,半胱氨酸巯基,色 　　氨酸的吲哚基,组氨酸的眯唑基,二硫键被修饰后,酶活性均显着下降,因此这些氨基酸残基是酶活性的必需基团,而精氨 　　酸残基及赖氨酸,一氨基被修饰后对酶活力没有影响,不是酶的必需基团. 关键词:菜青虫;N一乙酰一氨基葡萄糖苷酶;活性必需基团;化学修饰 中图分类号:Q356.i文献标识码:A文章编号:0438—0479(2006)06—0851—04 菜粉蝶(Pierisbrassicae)又名菜白蝶,昆虫纲鳞 　　翅目粉蝶科,其幼虫称为菜青虫,是菜粉蝶危害蔬菜的 　　主要形态.菜青虫主要侵食十字花科植物的叶,严重影 　　响蔬菜品质.多年来应用化学农药进行防治,但化学农 　　药的长期使用使害虫产生抗药性,并在蔬菜中产生残 毒,且造成环境污染.几丁质是由N一乙酰葡萄糖胺通 过p一1,4键连结起来的线性多糖,是许多生物的结构 性组分.几丁质不仅是昆虫的重要结构组分,而且也是 昆虫防止机械损伤和生物危害的屏障.昆虫在蜕皮期 间,必须降解几丁质,才能蜕去1日表皮,分泌新表皮,进 行正常的生长发育.昆虫中催化水解几丁质的是几丁 质水解酶,主要包括几丁质酶和N一乙酰一p—D-氨基葡萄 糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52).两者协同作用将几丁 质水解至单糖N一乙酰氨基葡萄糖[】].由于几丁质及 其水解酶在昆虫中的重要性,因此通过转几丁质水解 酶基因植物[2或其抑制剂D]都将起到破坏昆虫的生长 发育,达到杀灭害虫的目的. 　　我们已对菜青虫表皮的NAGase进行了分离纯 化,理化性质的研究?.在此基础上,进一步通过化学 修饰法探讨该酶活性部位的功能基团,为了解菜青虫 的生理生化特性提供理论基础,同时为筛选以该酶为 靶标的抑制剂开发新型生物农药奠定理论基础. 收稿日期:2006—03—24 　　基金项目:福建省自然科学基金(2006J0078),厦门大学科技创新 工程基金(XDKJC资助 　　作者筒介:石艳(1971一),女,讲师,在职博士生. *通讯作者:chenqx@jingxian.xmu.edu.cn 　　1材料与方法 　　N一乙酰一p—D一氨基葡萄糖苷酶从菜青虫表皮分离 纯化得到.通过解剖获得五龄菜青虫表皮,用含0.1 mol/LNaC1的0.05mol/LPBS(磷酸盐缓冲液,pH = 　　6.8)抽提,硫酸铵分级分离以及SephadexG-200, 　　羟基磷灰石柱层析分离纯化获得PAGE和SDS— PAGE为单一蛋白带的酶制剂,纯酶的比活力为8715 U/mg;对硝基苯一N一乙酰一p,D-氨基葡萄糖苷(pNP— NAG)为上海医药工业研究院生化室产品;N一溴代琥 珀酰亚胺(NBS),碳化二亚胺(EDC),二硫苏糖醇 (DTT)为Sigma产品;对一氯汞苯甲酸(pCMB)为Karl Roth产品;溴代乙酸(BrAc),乙酰丙酮等为上海试剂 一 　　厂产品;其它试剂均为国产AR纯,所有溶液均以 Millipore纯水系统制备的超纯水配制. 　　酶活力测定方法参考文献[4],以pNP—NAG为底 物,在2.0mL的反应体系中,含pH=6.2的0.15 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)和0.25mmol/LpNP— NAG,加入1OL酶液,在37?下准确反应10min,加 入2.0mL0.5mol/L的NaOH终止反应,在752型 Spectrum紫外可见分光光度计上测定波长为405nm 的光密度值(OD.),消光系数按8.8o×10L/(mol ?cm)计算. 　　?ShiY.JiangZ,HanP,ata1.Purificationandsome 　　PropertiesofB—N—AcetykD-glucosamin