proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的-生物通.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（８）：５１５８ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ ｐｒｏＣ及ｐｕｔＰ基因的敲除对钝齿棒杆菌产 Ｌ精氨酸生理代谢的影响 １ １ ２ ２ １ 万　方 　张　斌 　陈民良　陈进聪 　陈雪岚 （１江西师范大学生命科学学院　南昌　３３００２２　２南昌大学生命科学学院　南昌　３３００４７） 摘要　为了选育精氨酸高产菌株，基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导，以钝齿 棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）ＭＴＭ４为出发菌株，通过基因敲除技术构建了ｐｒｏＣ和ｐｕｔＰ敲 除菌株。摇瓶发酵结果表明，ｐｒｏＣ敲除菌株精氨酸产量达到 ９．９４ｇ／Ｌ，较出发菌株提高了 １５．９０％，葡萄糖转化率提高了２６．０２％。由于其生长受到明显抑制，因此在发酵液中外源添加 ２４ｍｍｏｌ／Ｌ的脯氨酸，结果发现其精氨酸产量达到 １２．２２ｇ／Ｌ，且菌株恢复生长。ｐｕｔＰ敲除菌株精 氨酸产量达到１２．２３ｇ／Ｌ，较出发菌株提高了４２．７０％，葡萄糖转化率提高了４９．３１％。以上结果 显示，ｐｕｔＰ的敲除比ｐｒｏＣ的敲除更有利于精氨酸的合成，ｐｕｔＰ的敲除对菌株的生理代谢基本无影 响且无需外添加脯氨酸。 关键词　钝齿棒杆菌　精氨酸　基因组尺度代谢网络模型　基因敲除　生理代谢 中图分类号　Ｑ７８９ 　　Ｌ精氨酸（合成途径见图１）是一种含有胍基的碱 性氨基酸，虽属人和动物的半必需氨基酸，但在机体的 物质代谢、免疫功能等生理功能方面发挥重要的作 ［１２］ ［３］ 用 ，因此在医药及食品工业中具有广泛的用途 。 现今，Ｌ精氨酸的工业生产主要通过微生物发酵生 ［４５］ 产 。如何通过分子育种获得高产精氨酸的微生物 ［６７］ 菌种，是科研工作者关注的核心问题 。早期对菌种 的改造主要集中在精氨酸生物合成途径上，包括敲除 负调控基因，改造精氨酸反馈抑制关键酶的靶点，增加 途径酶的表达等手段达到提高精氨酸产量的目的［８９］。 而精氨酸的生物合成却是通过细胞内的代谢网络进行 的，因此从全局的角度去系统地分析细胞的代谢网络 对微生物的精氨酸分子育种具有重要的意义。 图１　Ｌ精氨酸和脯氨酸生物合成途径 　　基因组尺度代谢网络模型（ＧＳＭＮ）作为系统生物 Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｓｏｆａｒｇｉｎｉｎｅａｎｄｐｒｏｌｉｎｅ ［１０］ 学研究的重要工具 ，是以物种的全基因组序列和代 谢通量分析方法为基础，通过软件分析发现一些重要 对代谢网络的影响等，从而能从全局掌握细胞的代谢 的改造靶点，预测改造后产物产量变化并分析改造后 过程，最终达到提高终产物产量的目的［１１１２］。本课题 组前期工作依据谷氨酸棒杆菌 （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ 收稿日期：２０１５０３１９　　修回日期：２０１５０４１７ 国家自然科学基金资助项目３０９６００１２） ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２与本试验室保存的钝齿棒杆 通讯作者，电子信箱：ｘｕｅｌａｎｃｈｅｎ１６２＠１６３．ｃｏｍ 菌高度同源（高达９９％）的特点，以Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ的 ５２ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．８２０１５ ［１３］ ＧＳＭＮ模型 Ｃｇ＿ｉＫＫ４４６指导Ｃ．ｃｒｅｎａｔｕｍ的