培养基的配制、分件装、灭菌.pptVIP

培养基的配制、分装和灭菌 一. 实验目的 二. 实验材料 （一）培养基的制备 （1）培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合 成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材 料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微 生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和 配制方法。 （2）制备流程： 称量→溶解→蒸煮→调pH→分装→包扎→灭菌 (3)操作步骤： 1）称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol?L-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol?L-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。 5）分装 披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜。灭菌后垂直待凝。 6）加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3／5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7）包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37℃温室培养24h，无菌生长者方可使用。 （4）关键步骤及注意事项 ①要严格按配方配制。 ②调pH不要过头。 ③干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。 ④高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 （二）灭菌 灭菌：用物理或化学的方法杀灭物体上一切微生物。 （1）干热灭菌法：把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温 至160oC，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用 具等的灭菌。 （2）高压蒸汽灭菌法（一般121oC，30min，适用培养基）： 把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进 行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上 升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055 公斤/厘 米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121oC。在这种 情况下，微生物（包括芽孢）在15～20 分钟便会被杀 死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等 面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时 间。 高压蒸汽灭菌法 1．加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的 水，以水面与三角架相平为至。 2．装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培 养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶 壁，以防冷凝水沾湿棉塞。 3．加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌 桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧 相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀； 4．排气 加热。待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔 排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排 净。 5．升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始 上升。 6．保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。 开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121℃， 20min灭菌。 7．降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下 降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅 盖，取出灭菌物品，倒掉锅