e.cli与b.subtilisγ谷氨酰基转移酶的重组表达及其催化合成l茶氨酸的研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 本论文是在黄磊副教授和徐志南教授的共同指导下完成的。首先感谢我的导 师黄磊老师，黄老师扎实的理论学识、严谨的科学态度和对工作的认真负责，使 我受益匪浅。同时要感谢徐志南教授，徐老师丰富的实践经验、渊博的专业知识、 创新的思维、严谨务实的科学态度和对科研事业的执着追求给我留下了深刻的印 象。在此，对两位老师表示衷心的感谢和深深的敬意! 另外，还要感谢课题组的蔡谨老师在本人攻读硕士期间对我的关心与指导， 他的教诲对我的科研提供了重要的帮助。 感谢三年来与我互勉共励的课题组成员。特别感谢博士生唐云平，在我初进 实验室时就给予我无私的指导和帮助，在科研过程中给予了我极大的鼓励与协助； 同时感谢本实验室的博士生章芸、赵伟军、李晓燕、濮悦、王海蛟、司振军、肖 锋、姜睿康、刘伟和董昌等，硕士生来力、王钦沪、庄冰佳、周丽春、吴青树、 陈斌斌、黄一峰、胡斌和姜灵轩等人的热情帮助，感谢他们陪我度过这一段宝贵 的人生历程。 本人能顺利完成硕士阶段的学习，与父母、亲人和朋友的关心、帮助是分不 开的，在此谨向父母、亲人和朋友表示衷心的感谢和深深的敬意。他们不仅在学 业上，还在生活上给予了我许多帮助。 谨向所有关心和帮助过本人的老师、同学、朋友和亲人再次表示衷心的感谢! 黄锋 二零一六年五月于求是园 万方数据 浙江大学硕士论文 浙江大学硕士论文 摘要 摘要 L．茶氨酸是一种存在于茶叶中的游离氨基酸，具有降血压、抗肿瘤和保护神 经等多种生理功能，在食品与保健品领域有着广泛的应用。丫．谷氨酰基转移酶 (Y．glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2．3．2．2)能够催化谷氨酰胺与乙胺反应生 成L．茶氨酸，且反应过程不需要ATP的参与，因此利用GGT来催化合成L．茶 氨酸成为了目前研究的热点。本研究首先利用大肠杆菌表达来源于大肠杆菌和枯 草芽孢杆菌的v．谷氨酰基转移酶，随后将其用于L．茶氨酸的酶法合成并对催化 条件进行优化，最后利用阳离子交换层析法分离纯化L．茶氨酸。本文的主要研 究内容如下： 首先，构建了含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GGT基因的重组质粒 pET28a．EGGT和pET28a—BGGT。将其转化到E coli BL21(DE3)中，并对重组菌 的培养条件表达条件进行优化，通过亲和层析分别纯化获得重组EGGT和BGGT 蛋白，并对其酶学性质进行表征。 其次，分析了GGT催化L．茶氨酸合成反应中的副产物，明确了反应中存在 着以下三种副反应：(a)L．谷氨酰胺不可逆的降解为L一焦谷氨酸；(b)GGT催化 L．谷氨酰胺的自转肽反应生成丫．谷氨酰基．谷氨酰胺(Y—glu—gln)；(C)L．茶氨酸 的自转肽反应生成v．谷氨酰基．茶氨酸。优化了大肠杆菌来源的GGT催化L．茶氨 酸合成的反应条件，得到最优的反应条件为：在10 mLNa2C03-NaHC03缓冲液 (100 mM，pHlO．0)中，添加300 mM L．谷氨酰胺和1．8 M乙胺盐酸盐，加入 重组菌菌体15 mg／mL，在30。C下反应12 h，L-茶氨酸的最高合成量可达28．2 g／L， L．茶氨酸对L．谷氨酰胺的转化率为55．20％。 再次，优化了B．subtilis来源的GGT催化L．茶氨酸合成的反应条件：以300 mM谷氨酰胺和3 M乙胺盐酸盐为底物，以100 mM NazC03．NaHC03为缓冲液 (pH 10．5)，加入湿菌体30 mg／mL，于30。C下反应6 h，L．茶氨酸的产量为34．65 g／L，L．茶氨酸对L．谷氨酰胺的转化率为64．88％。为提高L．茶氨酸产量，考察了 不同分批补料方式对L．茶氨酸合成的影响。选择以100 mM L．谷氨酰胺为初始浓 度，当L．谷氨酰胺不足20 mM时，补加100 mM L．谷氨酰胺的方式，经过四次 11 万方数据 浙江大学硕士论文 浙江大学硕士论文 摘要 补加，L。茶氨酸可达63．209／L。 最后，利用离子交换树脂纯化L一茶氨酸，选择HZ016阳离子树脂为交换介 质，建立了从酶促反应液中纯化L．茶氨酸的方法，L．茶氨酸的纯度为94．6％，L． 茶氨酸的总回收率达到40．4％。 关键词：L．茶氨酸，Y．谷氨酰基转移酶，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，分离纯化 III 万方数据 浙江大学硕士论文 浙江大学硕士论文 Abstract Abstract L．theanine is a unique amino acid that is naturally found in tea plants．L—theanine has many favorable physiological effects，such as lowerin