e3泛素连接酶rnf138功和分子机制以及rnf138和ctcf对dna损伤应答分子机制的研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 北京协和医学院博士研究生学位论文1 北京协和医学院博士研究生学位论文 1．12 条件性敲除RNFl38基因对小鼠生育力的影响 ．5l 2． 敲除RNFl38基因小鼠及对照小鼠睾丸深度测序分析 52 2．1 测序样本的验证 ．52 2．2 测序组装结果及统计 ．52 2_3 基因结构分析 ．55 2．4 SSR分析 ． 56 2．5 基因表达量分析 ．57 2．6 RNA．Seq整体质量评估 58 2．7 差异表达分析 ．59 2．8 基因功能注释 ．61 3． 泛素连接酶RNFl38在同源重组修复通路的功能和机制研究 64 3．1 RNFl 38可以被招募到DNA损伤部位 65 3．2 RNFl 38可以通过ATM在Seri24磷酸化 一66 3．3 RNFl 38积累的DNA损伤位点通过其锌指结构域 69 3．4 RNFI 38在调控HR修复途径参与 ．．71 3．5 RNFl 38参与DNA损伤修复 72 3．6 RNFl38泛素化RAD51D促进同源重组修复 ．74 4． 锌指结构CTCF在DNA损伤应答中识别PAR 77 4．1 前言 ．77 4．2 CTCF是DNA损伤反应蛋白可以招募到DNA损伤 77 4．3 CTCF招募到DNA损伤位点通过PAR介导 ．．79 4．4 CTCF的ZNF结构域识别PAR 80 4．5 CTCF招募到DNA损伤位点ZNF4．6。 ．82 4．6 ZNF4．6 CTCF域识别PAR 84 4．7 CTCF与PAR结合和与DNA结合的关系研究 ．．86 4．8 CTCF参与DNA损伤修复 87 4．9 介导的DNA损伤的DNA损伤反应中表征DNA损伤修复区域的边界 ．89 讨论 ．．9l 结{仑 一93 参考文献 94 附录：英汉名词对照 ．102 综j盎 l 03 博士在读期间论文与会议摘要写作情况 ．12l 独创性声明 ～l 22 学位论文版权使用授权书 ．1 22 致谢 ．1 23 万方数据 北京协和医学院博士研究生学位论文中文摘要 北京协和医学院博士研究生学位论文 中文摘要 精子发生是雄性生殖细胞受高度复杂调控的发育过程，包括三个重要阶段：精 原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞变形。随着核固缩，线粒体重排， 过渡蛋白和鱼精蛋白替换组蛋白，顶体形成等过程，最终形成具备传递父源遗传信 息能力的终末分化生殖细胞．成熟精子。小鼠和大鼠高通量基因表达数据表明精子发 生过程需要大量的睾丸特异性表达基因参与调控。据估计在小鼠的基因组中，大约 有4％的基因特异表达于精子发生过程的各个阶段。 RNFl38，即RING(Really Interesting New Gene)Finger protein 138是本组前期 在精子发生的研究工作中首先发现的含有RING Finger结构域且具有E3泛素连接 酶活性的蛋白质。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，由泛素激活酶E1、 泛素结合酶E2和泛素连接酶E3在内的一系列酶促反应协同完成。大量的研究证实， 泛素化修饰除了参与蛋白质降解，还与蛋白激酶的激活、膜泡转运、DNA损伤修 复和染色质重塑等一系列细胞生理过程密切相关。一些哺乳动物睾丸特异性表达的 E3泛素连接酶在精子发生的不同阶段执行多种不同的生物学功能。其中一些E3泛 素连接酶以及相关复合物在减数分裂过程早期的DNA双链断裂(DSB)和组蛋白 修饰发挥重要作用。 我们检测了不同日龄小鼠睾丸组织RNFl38蛋白质表达水平，结果显示RNFl38 的表达量随睾丸发育阶段的成熟而增加，在第一波生精波(5周)完成时，开始趋 于稳定，显示了其发育阶段表达特异性。免疫组化和免疫荧光结果显示RNFl38在 除精原细胞以外的各级生精细胞的胞浆均有不同程度的表达，尤其在初级精母细胞 表达最高，在这个阶段初级精母细胞开始进入减数第一次分裂，这也提示RNFl38 可能参与生精细胞的早期发育。 为了深入研究RNFl38对雄性生殖的功能，我们利用Cre．10xP或者FIp．FRT同 源重组系统构建了Vasa．Cre条件性基因敲除小鼠动物模型。结合RNFl38基因敲除 动物模型表型分析，与对照组比较发现RNFl38基因条件性敲除小鼠各个发育阶段 的睾丸重量和精子数量显著降低。形态学方面，RNFl38基因敲除后早期的精子发 生过程阻滞，早期部分生精细胞脱落，尤其是精母细胞数量显著减少。TUNEL结 果显示精母细胞凋亡增加。 转录组测序被广泛应用于功能基因组学研究中。转录组测序数据可以丰富和验 证基因组数据的注释，同时用于不同样本间基因表达差异、可变剪接等的比较。大 量且快速地充实样本的遗传数据，这些数据资源可有助于深入开展分子生物学机制 研究。因此为了深入研究RNFl38在雄性生