实验二-碱性磷酸酶提取与其比活性测定.pptVIP

碱性磷酸酶的提取及其比活性测定 碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase 一、实验目的 1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法； 2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算； 3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。 二、实验原理 1、 AKP概述 ① 催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用 ②最适pH：8.6～10.3 ③ 特点：特异性低 ④体内位置：细胞膜表面 -肾小管的筛状缘 -肠粘膜的微绒毛 -胆小管的细胞膜缘 -肝窦状腺表面 -胎盘合体细胞滋养层细胞外表面 ⑤正常血清： ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。 ⑥临床意义：血清ALP活力增高常见于 -肝胆疾病（胆道阻塞等） -骨骼疾病（佝偻病等） -甲状腺功能亢进 -妊娠和生长期儿童 2、AKP的分离、提取、及纯化 ① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织 ② 生物组织与细胞的破碎 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎 反复冻融法 ： 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞 ③ 选择合适分离提取方法 有机溶剂方法—— 有机溶剂分段沉淀法 原理： 利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。 有机溶剂： ① 正丁醇 能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中 ② 乙醇 30% AKP 溶解状态 60% AKP 沉淀状态 ③ 丙酮 33% AKP 溶解状态 50% AKP 沉淀状态 ④ 保护酶活性措施 低温条件下操作 所有试管均需洗干净 选择合适的pH及合适的缓冲体系，以稳定酶活性 三、操作步骤 2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管 加 0.01M Mg(Ac)2- 0.01 M NaAc 混合液2ml ，匀浆 匀浆液入离心管 用4ml上述混合液冲洗匀浆器，并倒 入离心管，混匀，记体积VA ? A液 A1管 A2管 剩余A液 0.1 ml A液 + 0.1 ml A液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris 4.9 ml 生理盐水 上述滤液 加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟 上清入回收瓶 沉淀 加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2, 搅拌，记体积VB ? B液 二、实验原理3、建立测定酶比活性的方法 比活性： 指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位 比活性= 酶活性单位数 / mg 蛋白 ① 测定酶活性 磷酸苯二钠法 原理： AKP活性单位定义: 37℃, 反应15分钟, 产生1ug苯酚 一个AKP活性单位（u） 计算酶活性： 各制剂总AKP单位数（U） = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积 考马斯亮蓝法 （Coomassie Brilliant Blue G-250 ，Bradford法） 考马斯亮蓝G-250——红色和蓝色 计算蛋白质含量： 各制剂总蛋白含量（mg） = 查表所得值 ×稀释倍数 × 总体积 ③ 各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算 1、AKP比活性： AKP比活性（U/mg）= 2、得率 得率