第七章哺动物胚胎干细胞技术.ppt

常规培养法 未去透明带的胚泡培养3－4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来； 胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min； 解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养4天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团； 胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。 视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 五.ES细胞的保存 1.常规保存：通过不断的更换分化抑制培养液，以传代培养方式维持ES的不分化状态。如人的ES细胞在体外培养传代2年仍维持不分化状态。 2.冷冻保存：通过超低温冷冻保存使细胞的代谢活动完全停止，达到长期保存的目的。 六.ES细胞的鉴定 通过分离培养获得的ICM或PGCs细胞在传到8~12代时，需要通过生化或细胞生物学指标的鉴定最终确认为ES细胞系。 1.形态：呈克隆状生长，即单个ES细胞能繁殖呈形态、功能和遗传基础完全相同的一簇细胞，并凝聚成团，外观形似鸟巢。 2.阶段特异性胚胎抗原(SSEA)：对细胞表面的SSEA通过化学方法检测，先将细胞用多聚甲醛固定，在用生物素标记的二抗和辣根过氧化物的底物处理，来鉴定细胞表面的特异性糖蛋白。 3.端粒酶检测：通常ES细胞端粒酶水平远高于其他分化的体细胞，可用正常体细胞或癌细胞做对照，用专用试剂盒检测。 4.Apase（碱性磷酸酶）：可通过组织化学方法鉴定，细胞经乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物，即可鉴定Apase的表达水平，都应该为阳性。 5.核型分析：传到2~5代时需要进行核型分析，分析时先在细胞培养液中加入一定浓度的秋水酰胺，使细胞同步在M期，然后用低渗溶液处理，经乙醇冰醋酸溶液固定后染色和显微照相，最后进行核型分析，检测细胞是否维持在二倍体状态。 6.发育分化潜力： （1）体外诱导分化：是把ES细胞培养在无分化抑制物的普通培养液中，如果ES细胞能自动聚合并分化形成胚状体，可初步确认具有发育多能性； （2）畸胎瘤实验：把ES细胞注射到有免疫缺陷成年小鼠或遗传同质动物的皮下或肾脏、睾丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可初步判定为细胞具有多能性。 （3）嵌合体实验：把培养的ES细胞与早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES细胞注入囊胚腔，然后让重组胚在体内继续发育，通过检测后代的嵌合状况，分析ES细胞的分化潜力。只有当操作后的胚胎发育为嵌合体，注入的细胞能分化为内、中和外三胚层细胞，并参与细胞生殖干细胞形成时，才能确认为ES细胞。 目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指标。 1 如何维持体外扩增时不分化？ 2 分化细胞的增殖是一个瓶颈问题：数量和纯度 3 如何定向诱导干细胞的分化？明确干细胞发育的调控机制 4 胚胎干细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破 5 如何克服移植排斥问题？破坏或改变细胞许多基因的可行性，核移植是否激活卵细胞的沉默基因，是否改变染色体结构？ 6 胚胎干细胞的安全性如何？畸胎瘤，肿瘤形成？ 7 伦理之争 七.ES细胞技术目前存在的问题 1.ES细胞系的分裂效率低 主要原因是缺乏理想的分离培养体系，目前对于ES干细胞维持多能性的分子机理缺乏了解，不能根据细胞分化特点和维持不分化的营养要求，建立合理的培养体系，是目前存在的主要问题。 2.ES细胞定向诱导分化的理论和技术水平低 目前的技术还无法对ES细胞实施专一的诱导分化，即分化为特定的细胞类型，如神经或心肌细胞等。 3.ES细胞治疗中面临的免疫排斥和致癌问题 外源的ES细胞移入病人机体后，细胞表面的组织相容性抗原将激活免疫系统，出现排斥反应，导致移植失败。 目前关于这方面的机理研究较少，克服排异反应的技术还不具备。 4.ES细胞目前无法培育出完整的器官 5.人ES细胞分离培养面临的伦理法律问题 获得ES细胞，必须毁坏人的早期胚胎或胎儿，与宗教的教义和社会伦理相违背，同时还违反国家法律，所以公众很难接受。 八.ES细胞技术的发展方向 1. ES细胞维持自我更新和定向分化的分子机理 2. ES细胞治疗技术的研究 用ES细胞修复病变或创伤组织将会引起一场医学革命，如何将两者结合起来非常复杂。 3. ES细胞作为工具探讨基因功能和个体的发生发育 随着人和其他哺乳动物的基因组计划完成后，基因的表达调控规律和在生命活动中的功能研究迫在眉睫。 应用嵌合体技术，以特殊基因标记的ES细胞作为探针，研究未知基因的功能，探讨器官的发生、发育规律，将是医学、动物科学和发育生物学研究的前沿领域。 4. ES细胞治疗中的免疫排斥问题 5.治疗型克隆技术：用病人的正常细胞作为核供体，通过细胞核移植方法获得囊胚，然后分离培养ES细胞，再用ES细胞修复衰老或功能异常的器官、组织。但是人细胞核移植技术研究在很多国家是被禁止的，所以这类研究比较困难。 6.用ES细胞生产转基因家畜 ES细胞易于基因打靶和基因敲