H3K27me3去甲基化UTX JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式.docxVIP

内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 H3K27me3去甲基化酶UTX、JMJD3在小鼠 孤雌胚胎中的表达模式 摘要 UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)和JMJD3 (jumonji domain containing protein 3)组蛋白去甲基化酶可以特异性地去除组蛋 白H3第27位的三甲基化修饰，使基因得到激活。UTX与JMJD3在胚胎干细胞 的多能性维持和肿瘤发生过程中起着重要的生物学作用。然而，到目前为止， UTX与JMJD3在早期胚胎发育过程中的作用还不清楚。 我们首先根据NCBI上GenBank数据库中小鼠UTX和JMJD3的mRNA序 列，分别对应UTX和JMJD3设计了2对和3对引物。采用分段式PCR的策略， 选择pMDl9一T为过渡载体，将测序正确的分段PCR产物逐个连接，最终，成 功地构建了具有T7启动子的pMD 1 9T-T7UTX和pMD 1 9T-T7JMJD3体外转录表 达载体。体外转录后，UTX与JMJD3 mRNA产物电泳条带清晰，并且大小与预 期相符。通过显微注射将UTX和JMJD3的rnRNA注射进小鼠的卵母细胞中。 经免疫荧光检测后，H3K27三甲基化修饰明显减少。说明，我们构建的UTX与 JMJD3体外转录载体在细胞水平能够翻译出具有活性的蛋白。 之后，我们通过实时定量PCR技术(Real．time Quantitative PCR，RT-qPCR)， 对孤雌激活胚胎(Parthenogenetic activation，PA)中UTX、JMJD3的表达情况进 行检测。结果表明，UTX与JMJD3在MII期的卵母细胞中表达量较高。随着胚 万方数据 H3K27me3去甲基化酶UTx、JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式 H3K27me3去甲基化酶UTx、JMJD3在小鼠孤雌胚胎中的表达模式 宋丽爽 胎的发育，UTX与JMJD3开始逐步降解，到囊胚时期到达最低点。为了进一步 揭示UTX与JMJD3在孤雌胚胎中的作用，我们采用siRNA(Small interfering RNA，siRNA)干扰技术，通过显微注射对MII期的卵母细胞中的UTX和JMJD3 分别进行敲减。经RT-qPCR检测，UTX和JMJD3的敲减效率分别为90％和70％。 并且发现当敲减UTX和JMJD3中的任何一个，另一个基因表达量将会随之增 加。对孤雌激活的8一细胞和桑椹胚进行免疫荧光染色，结果表明，单独干扰UTX 或JMJD3均未检测到H3K27me3的荧光信号，而UTX和JMJD3双敲减组则检 测到明显的H3K27me3信号。最后，又对孤雌激活的2一细胞进行UTX和JMJD3 蛋白水平上的检测，Western blot结果与实时定量PCR相符，敲减UTX和JMJD3 其中一个，另一个的蛋白表达量也会相应的增加。 以上结果说明，在mRNA和蛋白水平上，UTX和JMJD3存在功能互补。 这一新的发现，为我们进一步研究UTX、JMJD3在小鼠植入前胚胎发育的机制 提供了新的线索。 关键词：表观遗传学；UTX；JMJD3；H3K27me3；孤雌激活：早期胚胎发育 万方数据 内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 T皿EXPRESSIoN PA!rTEI己N OF H3K27me3 DEME田}m，ASE UTX AND盯订JD3Ⅱ呵MOUSE PARTHENOGENETIC EⅣ田；RYOS AB STRACT Histone methylate call be removed specifically from Histone 3 lysine 27 t ri．methylation(H3K27me3)by H3K27me3 demeth37lases UTX(ubiquitously tra nscribed TPR gene on the X chromosome)and JMJD3(jumonj i domain contm ning protein 3)，which cause the activation of gene expression．UTX and JMJ D3 play an important role in ESC(embryonic stem cell)self-renewal，cell diff erentiation and the formation of cancers．But，SO far，the roles of UTX and J MJD3 in the development of embryos are not clear． First，we designed two an