第十章氨基酸多肽和蛋但白质类药品检验.ppt

第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 ②微量双缩脲法 有些样品中蛋白质含量很少，在常量双缩脲法测定范围之外，可选用微量法进行测定。 该法显色原理与双缩脲法相同，由于铜与蛋白质复合物的最大吸收峰260～280nm，但在此区域干扰因素及空白吸收都很大，而选在310～330nm测定干扰因素少一些，但仍比540nm测定灵敏10倍以上，因此可选用310nm进行比色测定，测定范围为0.1～1.0mg/mL；或用330nm测定，测定范围为0.2～2.0mg/mL。 干扰此测定的物质包括组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、Tris、乙醇胺、硫酸铵、尿素、去垢剂等。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 A、溶液的配制 标准蛋白质溶液 1.0或2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液。 微量双缩脲试剂 称取173g枸橼酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）、100g无水碳酸钠一起溶于温水中，称取17.3g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于100mL水中，两者合并用水稀释至1000mL。 该试剂可长期保存，若出现黑色沉淀需重配。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 B、标准曲线及样品测定 取7支试管分别加入标准蛋白溶液0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，用水补足至1.5mL，加6％氢氧化钠溶液1.5mL混匀，再加0.15mL微量双缩脲试剂，混匀后在室温（20～25℃）保温15min，然后在310nm或330nm波长处进行比色测定，作标准曲线。 1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液的A310约为1.04，A330约为0.67。 C、样品测定 取1.5mL样品同上操作，从标准曲线上查得其浓度。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 （3）福林酚试剂法 蛋白质与福林酚试剂反应后形成的化合物可在750nm波长处测定吸收度，计算蛋白质的含量,测定范围为0.03～0.3mg/mL；或500nm波长处测定，范围为0.05～0.5mg/mL。 该法标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 福林酚试剂的已知干扰因素包括Tris、HEPES、MOPS、MES、CAPSTES、CHES、枸橼酸、琥珀酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、N-二（羟乙基）甘氨酸、甘氨酰甘氨酸等缓冲液；EDTA、EGTA等鳌合剂；蔗糖、甘油、氨基葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、木糖类山梨醇等糖类；酚、二巯基苏糖醇、巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸等还原剂；汞、锰、钴等二价金属离子；Triton、Tween、Lubrol等去垢剂以及乙烯、乙二醇、聚乙烯、吡咯烷酮、载体两性电解质等。高浓度的尿素、盐酸胍、硫酸铵、硫酸钠、钾盐、三氯醋酸、乙醇、乙醚、丙酮、脂类等化合物也对测定有影响。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 A、溶液的配制 标准蛋白质溶液 0.3或0.5mg/mL牛血清白蛋白溶液。 福林试剂 试剂甲由下述三种溶液配制： 称取20g无水碳酸钠、4g氢氧化钠溶解于1000mL水中； 称取0.2g硫酸铜溶于20mL水中； 称取0.4g酒石酸钾钠溶于20mL水中。 测定前将三种溶液按100︰1︰1混合均匀，即得。 混合30min后使用，混合液只能当天配制。 三种溶液分开可长期保存。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 试剂乙（福林试剂）：试剂商店有售。 配制：在2L的磨口回流装置内加入100g钨酸钠，25g钼酸钠，700mL蒸馏水。 50mL 85％磷酸及100mL浓盐酸充分混匀后，以小火回流10h，再加入150g硫酸锂，50mL蒸馏水及数滴液体溴，然后开口继续沸腾15min，以驱逐过量的溴，冷却后定容到1000mL，过滤，溶液呈黄绿色。 以酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定，使酸度为1mol/L即得。 置于棕色瓶中冰箱保存。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 B、标准曲线 在试管中分别加入标准蛋白质溶液0、0.025、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50mL，用水补足到0.50mL，加试剂甲2.5mL混匀后在室温（20～25℃）放置10min，再加入0.25mL试剂乙，立即混匀，室温放置30min，然后在500nm或750nm波长处测定吸收度。 以标准蛋白质浓度为横坐标，吸收度为纵坐标作标准曲线。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 C、样品测定 把稀释至适宜浓度的样品按上述操作进行测定，测定吸收度通过标准曲线查得样品浓度。 该法显色时间受温度影响较大，要注意控制在同一条件下进行。 0.2mg/mL牛血清白蛋白溶液的A550约为0.33，A750约为0.56。 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 （4）紫外吸收法 ①280nm光