H3K27me3及去甲基化酶KDM6AB在小鼠核移植重构胚中的作用.docxVIP

内蒙古大学博士学位论文H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A／B在小鼠核移植重构胚中的作用 内蒙古大学博士学位论文 H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A／B在小鼠核移植重构胚中的作用 摘要 体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)是指将体细 胞核注入到去核的卵母细胞质中获得重构胚(Reconstructed embryo)， 由重构胚最终发育为后代的技术。细胞的重编程能够通过核移植、细 胞融合、特定转录因子以及培养条件诱导等方法来实现。但是目前唯 一能够诱导细胞重新发育成个体的重编程方法只有体细胞核移植，其 他方法只能够在细胞、分子或者生化的水平上产生诱导，并且都存在 一些不足之处。但是，自从体细胞核移植技术建立以来，克隆效率一 直处于较低的水平，只有很少的重构胚胎能够发育到足月出生，在小 鼠中通常只有1~2％的出生率。而且大多数克隆小鼠在出生后不久就 会死亡。成功出生的克隆小鼠也会出现胎盘巨大、胎儿过度生长等异 常症状，即所谓的“胎儿巨大症”。造成这一现象的主要原因是供体 细胞核不能够被完全的重编程(Reprogramming)所致。重编程主要 指的是表观遗传修饰(Epigenetic modification)的擦除与重建，主要 包括DNA的甲基化、组蛋白的乙酰化、基因组印记的重建、X染色 体的复活与失活以及端粒长度的再延伸等修饰的动态变化。 H3K27me3组蛋白去甲基化酶KDM6A／B(Lysine specific demethylase 6A／B)发现于2007年，与之相关的研究主要集中在去甲 基化的生化机理方面，研究KDM6A／B在核移植重构胚发育中的作用 还未见报道。 在本研究中，首先我们建立了一套可行的小鼠克隆技术方案。利 万方数据 H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A／B在小鼠核移植重构胚中的作用用卵丘细胞、胎儿的成纤维细胞和胚胎干细胞等3种细胞构建了重构 H3K27me3及其去甲基化酶KDM6A／B在小鼠核移植重构胚中的作用 用卵丘细胞、胎儿的成纤维细胞和胚胎干细胞等3种细胞构建了重构 胚，比较了这3种重构胚在不同激活液中的激活效率、不同培养液中 的发育效率和不同胚胎移植方法的妊娠效率等。结果表明，1) Ca2+_free KSOM激活液是通用的高效激活液，激活效率在93．5％左右； 2)KSOM—AA培养液适合于卵丘和胚胎干细胞重构胚的体外培养， 而胎儿成纤维重构胚的最佳培养液为aMEM培养液；3)当重构胚体 外发育至2．细胞时期，经输卵管双侧移植，每侧移植15枚胚胎可高 效获得核移植动物。 其次，我们对小鼠孤雌不同时期的胚胎进行H3K27me3修饰情 况进行检测，在小鼠8．细胞和桑椹胚中，检测不到H3K27me3的修 饰；在着床前胚胎中，KDM6A、KDM6B表达量很高，但8．细胞时 期胚胎中检测不到KDM6A的蛋白；在着床前胚胎中，KDM6A、 KDM6B在mRNA及蛋白质水平上存在着功能代偿现象；降低 KDM6B的表达量，有助于提高胚胎的囊胚率和囊胚质量(95．1％VS． 84．3％．P0．05)。 最后，通过干扰KDM6B提高了核移植胚胎干细胞的建系效率， 而且得到的si6B．ES的多能性明显要好于野生型ES细胞。通过以上 的优化，最终将克隆小鼠的出生率提高近6倍。 关键词：表观遗传；胚胎发育；体细胞核移植；克隆效率；胚胎 干细胞 万方数据 内蒙古大学博士学位论文The 内蒙古大学博士学位论文 The role of H3K27me3 and KDM6A愿in the mouse nuclear transfer embryos ABSTRACT SomatiC cell nuclear transfer(SCNT)is a technique for cloning．The nucl eus is removed from a healthy oocyte．This oocyte becomes the host for a nucleus that is transplanted from another cell，such as a cumulus cell． The reconstructed embryo can be used tO generate embryonic stem cells with a genetic match to the nucleus donor(Therapeutic cloning)，or can be impl anted into a surrogate mother to create a cloned individual，such as DollY the sheep(Re