LondonSwedish APP双突变转基因小鼠模型的建立和初步表分析.docxVIP

中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文OD 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 OD Optical Density 光密度值 PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS Phosphate--buffered Saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polytaerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基磺酸钠 TEMED N，N，N’，N’一tetra Methyl N’N，N’，N’-四甲基乙二酸 TBS I ris Bu舵r Saline Iris缓冲液 碱S Trishydroxymethylaminomethane 三羟甲基氨基甲烷 BSA 牛血清白蛋白 PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟 3 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文中文摘要 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 中文摘要 London／Swed i sh APP双突变转基因小鼠模型的建立和 初步表型分析 阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)是一种常见的中枢神经 系统退行性变性疾病，其主要临床表现为进行性记忆减退和认知障 碍。AD的主要神经病理学特征为过度的细胞外p淀粉样蛋i兰t(amyloid 13 protein，A13)沉淀、细胞内神经纤维缠结增多、Tau蛋白的过度磷酸 化、突触密度减少、神经元细胞减少等。为了更加深入的探究AD的 发病机制，研究人员建立了一系列的动物模型作为研究工具。淀粉样 蛋白前体蛋白(The amyloid precursor protein，APP)在AD发病机制中 起重要作用，APP经过剪切加工后的A13是AD患者脑内老年斑的主 要成分，而点突变的APP则是早发性AD(early onset of familial Alzheimers disease，FAD)的主要病因。目前国内外已经建立了多种 APP突变型转基因小鼠模型如PDAPP转基因小鼠模型，APP23转基 因小鼠模型等，但是大多数模型出现病理及行为学改变的时间比较滞 后，通常在六月龄以后才出现上述改变。因此我们建立了 London／Swedish APP双突变转基因小鼠，使小鼠能够比其它APP转 基因动物更早的出现病症，提高使用模型进行研究时工作效率。本研 究主要包括以下三个部分的实验内容： 1．London／Swedish hAPP双突变转基因载体及小鼠的制备：将 London／Swedish APP双突变基因插入到PDGF启动子下游，构建转基 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文因表达载体，通过显微注射法建立APP695v652汹盼舢帆转基因 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文 因表达载体，通过显微注射法建立APP695v652汹盼舢帆转基因 C57BL／6J小鼠。 2．分子生物学水平及病理学分析：采用PCR技术鉴定 APP695v6521魈9刚舢597L转基因小鼠的基因表型，鉴定出四只Founder 鼠。进一步用RT-PCR和Western blotting检测hAPP695V652ⅣK596N删597L 基因的表达，筛选并建立了2高表达的系APP695V652胀596N删597L转基 因小鼠。免疫组织化学显示在海马区双突变APP695V652幽96N舢597L转 基因小鼠出现的阳性细胞数目较单突变APP695v6521转基因小鼠及野 生小鼠明显增多。常规的病理学检查转基因小鼠脑组织未发现异常。 3．行为学检测：采用水迷宫检测系统对APP695v652‘觚96NM597L转基因 小鼠的行为学改变进行鉴定。结果显示，三月龄时 APP695V6521心96N胀97L转基因小鼠，单突变APP695v6521转基因小鼠及 野生小鼠在经过Morris水迷宫隐蔽平台实验时，APP695V6521晒9洲597L 转基因小鼠寻找到隐蔽平台的潜伏期比APP695V6521转基Nd,鼠及野 生小鼠明显延长。探索试验发现APPV6521帖96N舢597L转基因小鼠比 APPv6521转基因小鼠及野生小鼠穿越目标象限的次数明显减少。 综上所述，APP695V652撤596N似597L转基因小鼠较APP695V6521转基 因小鼠更早的表达m心P，出现学习认知能力障碍的时间明显提前，说 明我们成功建立APP695V652帐596N删597L转基因小鼠阿尔茨海默病模 型，为研究AD发病机制和药物研发提供了有价值的研究工具。 关键词：APP：阿尔茨海默病；转基因；小鼠模型；水迷宫 中国医学科学院中国协和医科大学硕士学位论文ABS