利用真空渗入法获得转基因抗虫先白菜及其转化机理的分析.docx

关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：{坠篓彭臧 导师签名： 日 期：—— 山东农业大学博士学位论文利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜 山东农业大学博士学位论文 利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜 及其转化机理的研究 学 院：园艺科学与工程学院 专 业：蔬菜学 研究生t徐恒戬 指导教师：王秀峰教授 刘凡研究员 摘 要 芸薹属(Brassica)包括100多个种，其中许多是重要农作物。多年来对芸薹属农作物 的研究，取得了巨大成就，特别是在改良种质、改善品质、提高产量等方面的工作，为 芸薹属作物的生产发展贡献极大。然而，传统的方法越来越受到自然条件的限制，主要 表现在种内基因资源不足，种闯基因资源配置障碍多等方面。生物技术的兴起，为克服 这些困难，实现种质资源的合理配置，提供了新的途径。通过基因工程的方法，转移重 要基因，已经获得成功。 目前，应用于芸薹属作物基因工程的方法，主要是由农杆菌介导的叶盘转化法。这 种方法在其它作物上获得了成功的应用，但也发现了许多问题，特别是由细胞变异引起 的畸形、发育障碍、基因型依赖性等问题，为其增加了许多困难，这些问题主要是由于 外植体的离体培养再生所引起，在芸薹属作物上表现更为突出，特别是白菜类作物，至 今无法获得稳定常规的转化方法。采用不需要组培技术的原位转基因方法，对芸薹属作 物的基因改良，将有着较好的推动作用。原位转化法包括种子转化法、浸花法、伤口接 种法、真空渗入法等一类方法，在拟南芥上获得较好的效果，但在重要经济作物上的应 用研究还未有重要进展。本研究利用真空渗入法，进行白菜转基因试验，成功地取得了 转化株。 1真空渗入法获得转基因抗虫菜心。 利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜及其转化机理的研究本研究首先以小白菜类的菜心为试材，利用农杆菌C58株系，通过真空渗入法，将 利用真空渗入法获得转基因抗虫白菜及其转化机理的研究 本研究首先以小白菜类的菜心为试材，利用农杆菌C58株系，通过真空渗入法，将 含有马铃薯蛋白酶抑制剂基因⑦inIf)、蜘蛛杀虫肽基因(sip)和筛选基因(bar)的T-DNA 转入到菜心中去。通过除草剂筛选，获得了抗性植株，通过分子检测证明，外源基因已 经完全整合到了菜心的基因组中。对PINII蛋白质的测量表明，pin曰基因得到了有效的 表达，PINII蛋白对牛胰蛋白酶的活性，具有较强的抑制作用，统计分析表明，抗性株 与非转基因株之间，存在极显著的差异。抗虫试验表明，小菜蛾的幼虫期、蛹重量、蛹 获得率，成虫获得率，不同的转基因株系之间，具有显著差异，拥有相同有效插入片断 的株系，其抗虫效果也不相同，表明各个转基因株系之间，外源基因的表达具有极大复 杂性和差异性，并从转基因株系后代中，筛选到较好的抗虫转基因株系。 2抗性基因的遗传与表达 真空渗入法转化菜心的结果显示，转化率较低，基本稳定在0．01％左右。转化株频 数与其亲本的种子量不呈直线关系，从数据分布图看，接近正态分布，这个结果表明了 转化事件的有条件性。被转化的种子多数分布在花序的上部，这说明农杆菌的转化目标 可能是处于早期生长发育阶段的花蕾。这个结果与下面的测交结果相吻合。 真空渗入法获得的转基因植株，采用测交的方法证明，测交后代的分离比是1：1， 这表明Tl代是杂合体，杂合体的结果说明，转化事件发生在TO代植株授粉之前的胚珠 或者花粉，而不是雌雄蕊分化之前的分生组织。 3真空渗入法获得抗虫大白菜及遗传分析 大白菜是芸薹属中最难转化的作物，不仅离体再生体系难建立，而且对农杆菌的侵 染过于敏感，容易导致外植体死亡。本研究采用真空渗入法成功地获得了抗性植株， Southern检测证明，外源基因整合到白菜的基因组中，呈现2个插入片断：RT-PCR表 明，外源基因能够顺利转录出mRNA；对PIN TEl蛋白的测定表明，mRNA能够被准确剪 接，翻译成蛋白，并对牛胰蛋白酶表现出抑制作用，统计分析表明与非转基因株对照差 异极显著。大白菜的Tl代转化株呈现为杂合体，自交后代呈现3：1、2：1、1：l的分 离比例，以转化株为花粉受体的测交后代分离