聚羟基洗脂肪酸酯pha合酶基因的克隆 表达及功能性研究.docx

摘要聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)，一种由微生物合成的聚酯， 摘要 聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)，一种由微生物合成的聚酯， 由于具有生物可降解性、生物相容性、光学性、压电性、气体相隔性等许多优良 性能，而有可能在众多领域，如生物降解性包装材料、组织工程材料和缓释材料 等方面得到广泛应用，因此正日益引起了科研领域及工业界的广泛兴趣。 本文对PHA合成过程中的关键酶一PHA合酶基因(phaC)进行了研究，旨 在通过发现一些具有特殊功能的PHA合酶基因，促进新型PHA的发现。论文取 得了如下研究结果： (1)建立了一种快速克隆II型PHA合酶基因的方法。该方法通过对5种己 知的假单胞菌PHA合酶基因的排列顺序及碱基序列的比较，在基因的外侧找到 了一些相对保守的区域。根据这些保守区的序列设计出两条用于PCR扩增的通用 引物，以细菌的基因组DNA为模板，采用特殊的PCR实验方案 降落PCR (Touch·down PCR)对II型PHA合酶基因进行了成功地克隆。该方法的特点是 简单易行、重复性好且适用性强。 (2)应用上面建立的克隆方法，从本实验室筛选到的四株不同PHA野生型 菌株中共克隆到7个II型PHA合酶基因。其中包括三株假单胞菌PseudomoHas pseudoalcaligenes YS 1、Pseudomonas pseudoalcaligenes HBQ06和Psedomonas nitroreducens 0802，以及一株伯克霍尔德氏菌BurkhotderiacaryophylliYSl3。通过对 获得的序列进行分析得到了完整PHA合酶基因(phaCl或phaC2)。对上述不同 PHA合酶的基因序列和氨基酸序列同源性分析表明，这些基因与已发表的PHA 合酶基因具有高度同源性。 (3)应用基因敲除的方法构建了一株大肠杆菌的脂肪酸降解庙扭缺失突变 株KM32B(fadB：：Tet)。经PCR验证力地基因已完全被四环素抗性基因(Tet) 取代。 (4)成功构建了含有上述II型PHA合酶基因的表达载体，并将它们分别转 (4)成功构建了含有上述II型PHA合酶基因的表达载体，并将它们分别转 入野生型大肠杆菌及脂肪酸降解fadB缺失突变株KM32B中进行表达。在多种野 生型大肠杆菌中，尽管使用了各种不同的表达载体，也很难获得可供检测的PHA； 但应用大肠杆菌的faaB缺失突变株却可以获得较多量的PHA。 (5)通过对伯克霍尔德氏菌B．caryophylli YSl3的研究，发现了该菌株PHA 合成的另一条途径。摇瓶发酵研究表明，B．caryophylli YSl3可以利用葡萄糖和多 种脂肪酸作为碳源，合成从4个碳原子数的聚羟基丁酸(PHB)到10个碳原子数 的聚羟基癸酸(PHD)在内的多种P}IA。对B earyophylliYSl3的分子生物学研究 发现，它拥有类似于假单胞菌的II型PHA合酶体系。其他对伯克霍尔德氏菌的 研究表明，该菌种至少拥有两条PHA合成途径，但到目前为止只发现了其中的 一条，即与Ralstonia eutropha相类似的I型PHA合酶体系。因此我们的研究结 果可以看作是对伯克霍尔德氏菌PHA合成途径的有力补充。 关键词： 聚羟基脂肪酸酯；PHA；聚羟基丁酸；PHB； PHA合酶； 大肠杆菌； 假单胞菌；PsP口do卅Dn口5；洋葱 伯克霍尔德氏菌；Burkh口lderta caryophylli AbstractPolyhydroxyalkanoates(PHA)，a Abstract Polyhydroxyalkanoates(PHA)，a family of intracellular polyester synthesized by many bacteria，have received increasing attention due to its excellent biodegradability, biocompatibility,optical activity and piezoelectricity,as well as potential applications in areas ofbiodegradable packaging，tissue engineering and drug delivery． This thesis focused on the study of PHA synthase gene 0hacO，which is a key enzyme for PHA production．The purpose of the thesis is to discover and pr