HIV1辅助蛋白Vpr多肽抗的鉴定与Vpr诱导细胞凋亡功能的研究.docxVIP

温州医学院硕士毕业论文V一1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与Vpr诱 温州医学院硕士毕业论文 V一1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与Vpr诱 导凋亡功能的研究 硕士研究生： 孙 俊 导 师：徐建青教授吕建新教授孟哲峰 中文摘要 目的 预测和鉴定中国HIV-1主要流行毒株Vpr蛋白的B细胞抗原表位，并通过表 位肽制备Vpr特异性抗体；研究Vpr蛋白不同功能基序诱导凋亡效应并鉴定新的 诱导凋亡基序。 材料与方法 1．根据公开发表的所有中国来源HIV-1 B亚型和CRF07 BC重组型毒株Vpr蛋 白序列，使用Bio—Edit软件生成共享序列，并综合利用ABCpred和Bcepred在线 分析软件预测HIV-1共享序列Vpr蛋白潜在的B细胞抗原表位。化学合成多肽 并与载体蛋白血蓝蛋白(Ⅺm)偶联，以此免疫家兔制各大量的抗血清。通过间 接酶联免疫吸附实验、Westem—Blotting及免疫沉淀鉴定多肽抗体的特异性，并以 亲和层析的方法纯化获得多肽特异性抗体。 2．以中国流行株B亚型和CRF07 BC重组型vpr基因序列为模板，利用Overlap PCR引入一系列无义突变，构建含不同Vpr功能区域的系列克隆，并将其转染 293T细胞和TZM—B1细胞，通过Armexin—V和PI染色，检测系列Vpr突变克隆 诱导细胞凋亡的能力。 ●士甲-‘1：1木 1．根据软件预测显示，Vpr蛋白N端的第3,～19位(N)和C端的第82,-一95位 (C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位；ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的 效价都达到1：105以上；Western—Blotting结果显示，无论对HIV-1 B亚型还是 CRF07 BC重组型的Vpr蛋白，其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别；免疫 沉淀结果显示，Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP ．Vpr融合蛋白。 2 温州医学院硕士毕业论文2．利用测序和生物信息学软件的方法，确定各无义突变克隆构建成功；流式检 温州医学院硕士毕业论文 2．利用测序和生物信息学软件的方法，确定各无义突变克隆构建成功；流式检 测显示，B亚型和CRF07 BC野生型Vpr、第54位突变型、第1．38位Vpr肽段 和第1—27位Vpr肽段，都具有明显的诱导TZM．BI凋亡的能力；与B亚型野生 型Vpr蛋白诱导凋亡效应比较，第1—54位Vpr肽段具备相似诱导凋亡的能力， 第1．38位和1．27位肽段诱导凋亡能力逐渐减弱，但在对293T细胞无明显凋亡 诱导效应；进一步的点突变实验证明，Vpr蛋白第23．38位氨基酸多肽结构域是 N端主要的凋亡基序。 结论 1．利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位，免疫所获得的抗 体具有较好的特异性和应用性。 2．利用Overlap PCR技术成功构建vpr基因无义突变克隆，初步证明Vpr蛋白N 端第23—38位氨基酸多肽结构域为新的凋亡基序。 关键词：HIV-1辅助蛋白Vpr；B细胞表位；表位预测；多肽抗体：细胞凋亡 温州医学院硕士毕业论文Developing 温州医学院硕士毕业论文 Developing Polyclonal Antibodies against HIV-1 Vpr-derived Polypeptides and analyzing pro·apopototic capacity of HIV-1 Vpr protein M．S．Candidate： Jun Sun Supervisor：Jianqing Xu 、Jianxin LuZhefeng Meng Abstract Background To predict the potential B cell epitopes of Chinese main circulating HIV-1 strains derived Vpr protein，and identify it by developing polyclonal antibodies；To identify the new pro-·apopototic domain of Vpr by analyzing the pro··apoptotic capacities of various length Vpr peptides． Materials and Methods 1．The prepared consensus Vpr amino acid sequences，which were produced from published Chinese HIV-1 CRF0^JC and B subtype Vpr sequences，were used to predict potential B c