HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学状的影响.docxVIP

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HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学状的影响

河北医科大学 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下,由本人独立完成。本 学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河 北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论 文主要内容相关的论文,第一署名为单位河北医科大学,试验材料、原 始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相 应法律责任。 研究生签名:声玉耳导师签章磐象仁二级学院领导盖章: 7口15年弓月司日 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文 中特别加以标注和致谢等内容外,文中不包含其他人已经发表或撰写的 研究成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自 负。 研究生签名:声0耻 导师签章: 加J孑年弓月)1日 万方数据 目 目 录 中文摘要 l 英文摘要 4 英文缩写 8 研究论文HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学行为 的影响 前言 9 材料与方法 ”10 结果 ··27 附图 ··30 附表 ··39 讨{仓 .. ··44 结{仑 47 参考文献 ·48 综述丙肝病毒颗粒对宿主细胞的侵入,组装和释放 ··50 致谢 一61 个人简历 ·62 万方数据 中文摘要HCV 中文摘要 HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学 行为的影响 摘 要 目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)是引起肝脏疾病的重要病原 体,感染者大部分发展为慢性感染,最后可导致肝纤维化,肝硬化和肝癌, 而且目前还没有有效的疫苗来预防HCV的感染。聚乙二醇化干扰素-Q (pegylated interferon 0【,PEG-IFN.仪)和利巴韦林(ribavirin,RBV)是治 疗丙肝的最佳药物,但仍有约为30%.50%的HCV感染者对该联合抗病毒 治疗无效。HCV core蛋白是病毒感染肝细胞后第一个表达的蛋白,在感 染的靶细胞和患者的血清中均可检测到其存在。HCV core蛋白不仅参与 病毒颗粒的组装,还可与靶细胞不同蛋白相互作用调节靶细胞的功能,包 括细胞的增殖,生长,凋亡等。 固有免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,肝脏组织中 的库否氏细胞是重要的固有免疫应答细胞,属于定居的巨噬细胞,参与机 体的免疫防御。目前认为,巨噬细胞是一类异质性很强的细胞群体,在组 织微环境中可被刺激分化为具有不同功能的细胞亚群。包括经典活化的 M1巨噬细胞、旁路活化的M2巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞等。本室 前期结果研究发现,HCV core蛋白可刺激巨噬细胞THPl分泌促炎和抑 炎因子,因此,本研究拟通过收集HCV core蛋白作用的THPl上清,从 不同的角度观察培养上清对正常肝细胞株L02、肝癌细胞株(HepG2、 SMCC.7721)的增殖、迁移、侵袭以及对干扰素作用的影响,并初步探 讨其机制,为进一步研究HCV core蛋白对巨噬细胞活性的影响提供实验 依据。 方法: 1构建与表达重组HCVCOre蛋白 从JFH.1株(HCv2a)全长基因质粒上通过PCR的方法扩增HCV core 基因,连接至pMDl8.T载体上,测序正确后,经BamH I,HindⅢ双酶切, 与pET28a相连,构建重组原核表达质粒pET28a-HCV core,双酶切鉴定。 经IPTG 37。C诱导获得表达core蛋白的包涵体,经纯化,复性和浓缩后, 万方数据 中文摘要行SDS和Western 中文摘要 行SDS和Western blot鉴定。 2获得HCV core蛋白作用的巨噬细胞m.THPl培养上清 PMA(10 ng/m1)诱导人单核细胞株THPl分化为巨噬细胞m.THPl, HCV core蛋白以20 pg/ml刺激m.THPl 24h后收集上清,离心。.80 0C保 存备用。同时设PBS阴性对照组与加HCV core蛋白无细胞的空白对照组。 3观察细胞培养上清对肝细胞生物学行为的影响 将收集的细胞培养上清用完全培养基20%或50%稀释后分别培养人 正常肝细胞L02、肝癌细胞HepG2或SMMC7721细胞:1)通过细胞增殖实 验(CCK8法),划痕实验,Transwell细胞迁移实验及克隆增殖实验观察 稀释后的培养上清对上述肝细胞细胞增殖,迁移能力的影响;2)通过实 时定量PCR检测三种肝细胞株MMP2和MMP9基因的表达变化;3) Westemblot检测三种肝细胞内转录因子NF.r.Bp65及MAPKs通路相关蛋 白(ERK,JNK,p38)的表达。 4观察细胞培养上清和IFN.a对肝细胞增殖的影响 在96孔细胞培养板中分别培养L02、HepG2和SMCC77

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