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HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学状的影响
河北医科大学
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7口15年弓月司日
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研究生签名:声0耻 导师签章:
加J孑年弓月)1日
万方数据
目
目 录
中文摘要 l
英文摘要 4
英文缩写 8
研究论文HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学行为
的影响
前言 9
材料与方法 ”10
结果 ··27
附图 ··30
附表 ··39
讨{仓 .. ··44
结{仑 47
参考文献 ·48
综述丙肝病毒颗粒对宿主细胞的侵入,组装和释放 ··50
致谢 一61
个人简历 ·62
万方数据
中文摘要HCV
中文摘要
HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学 行为的影响
摘 要
目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)是引起肝脏疾病的重要病原 体,感染者大部分发展为慢性感染,最后可导致肝纤维化,肝硬化和肝癌, 而且目前还没有有效的疫苗来预防HCV的感染。聚乙二醇化干扰素-Q (pegylated interferon 0【,PEG-IFN.仪)和利巴韦林(ribavirin,RBV)是治
疗丙肝的最佳药物,但仍有约为30%.50%的HCV感染者对该联合抗病毒 治疗无效。HCV core蛋白是病毒感染肝细胞后第一个表达的蛋白,在感 染的靶细胞和患者的血清中均可检测到其存在。HCV core蛋白不仅参与 病毒颗粒的组装,还可与靶细胞不同蛋白相互作用调节靶细胞的功能,包 括细胞的增殖,生长,凋亡等。
固有免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,肝脏组织中 的库否氏细胞是重要的固有免疫应答细胞,属于定居的巨噬细胞,参与机 体的免疫防御。目前认为,巨噬细胞是一类异质性很强的细胞群体,在组 织微环境中可被刺激分化为具有不同功能的细胞亚群。包括经典活化的 M1巨噬细胞、旁路活化的M2巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞等。本室 前期结果研究发现,HCV core蛋白可刺激巨噬细胞THPl分泌促炎和抑 炎因子,因此,本研究拟通过收集HCV core蛋白作用的THPl上清,从 不同的角度观察培养上清对正常肝细胞株L02、肝癌细胞株(HepG2、 SMCC.7721)的增殖、迁移、侵袭以及对干扰素作用的影响,并初步探 讨其机制,为进一步研究HCV core蛋白对巨噬细胞活性的影响提供实验 依据。
方法:
1构建与表达重组HCVCOre蛋白
从JFH.1株(HCv2a)全长基因质粒上通过PCR的方法扩增HCV core 基因,连接至pMDl8.T载体上,测序正确后,经BamH I,HindⅢ双酶切, 与pET28a相连,构建重组原核表达质粒pET28a-HCV core,双酶切鉴定。 经IPTG 37。C诱导获得表达core蛋白的包涵体,经纯化,复性和浓缩后,
万方数据
中文摘要行SDS和Western
中文摘要
行SDS和Western blot鉴定。
2获得HCV core蛋白作用的巨噬细胞m.THPl培养上清
PMA(10 ng/m1)诱导人单核细胞株THPl分化为巨噬细胞m.THPl, HCV core蛋白以20 pg/ml刺激m.THPl 24h后收集上清,离心。.80 0C保 存备用。同时设PBS阴性对照组与加HCV core蛋白无细胞的空白对照组。
3观察细胞培养上清对肝细胞生物学行为的影响 将收集的细胞培养上清用完全培养基20%或50%稀释后分别培养人
正常肝细胞L02、肝癌细胞HepG2或SMMC7721细胞:1)通过细胞增殖实 验(CCK8法),划痕实验,Transwell细胞迁移实验及克隆增殖实验观察 稀释后的培养上清对上述肝细胞细胞增殖,迁移能力的影响;2)通过实 时定量PCR检测三种肝细胞株MMP2和MMP9基因的表达变化;3)
Westemblot检测三种肝细胞内转录因子NF.r.Bp65及MAPKs通路相关蛋 白(ERK,JNK,p38)的表达。
4观察细胞培养上清和IFN.a对肝细胞增殖的影响 在96孔细胞培养板中分别培养L02、HepG2和SMCC77
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