嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁硫簇组装蛋白iscu和分泌蛋白的研究字-生物工程专业毕业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 摘要 摘要 嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans，以下简称 A．ferrooxidans菌)是存在于生物浸出和酸性矿区场地中研究最多的一 种微生物。与铁和硫氧化相关的能量代谢研究引起了国内外学者的广 泛关注，这不仅具有学术意义，也是出于经济和环境的考虑。为了更 加深入的认识已知氧化还原蛋白的生理作用及鉴定那些与铁和硫氧 化相关的未知的蛋白质，我们对嗜酸氧化亚铁硫杆菌的铁硫簇组装蛋 白IscU和由基因组编码的分泌蛋白进行了研究。 本研究在大肠杆菌中克隆和表达了IscU的基因，并通过一步亲 和层析法纯化出了蛋白质。SDS．PAGE显示纯化的IscU及其突变体 蛋白质对应16kDa，蛋白溶液为无色透明，表明是以apo的形式存在。 在DTT存在的条件下，apolscU于Fe2+和S2‘在厌氧条件下反应，变 成了有铁硫簇的褐色形式。紫外可见光谱及电子顺磁共振波谱结果表 明组装的IscU呈现出铁硫蛋白的特征信号，分别是在415nm处出现 吸收峰和g=2．013，揭示在Fe2+和S2’存在的条件下，在体外[Fe2S2】 可以在apolscU中组装生成。随着L．半胱氨酸加入到apolscU、IscA、 IscS和Fe2+的反应混合物中，在415nm处的吸收峰逐渐升高，表明 了在体外[Fe2S2】可以在其它蛋白的协助下以模拟细胞内的环 境生成，同时电子顺磁共振波谱结果g=2．013也进一步表明铁硫簇 在apolscU中生成。通过定点突变构建了蛋白的突变体C37A，D39A， C63A和C106A，紫外可见光谱及电子顺磁共振波谱和三维结构的分 子模拟结果证明了这些位点参与铁硫簇的结合。 利用信号肽预测软件SignalP v3．0、跨膜螺旋结构预测软件 TMHlVIM v2．0、双精氨酸信号肽预测软件TatP v1．0、脂蛋白信号肽预 测软件LipoP v1．0和非经典分泌蛋白预测软件SecretomeP对嗜预测 软件酸氧化亚铁硫杆菌全基因组的3137个氨基酸序列进行预测分 析。结果表明，在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中有462个蛋白为分泌蛋白，其 中含分泌型信号肽的蛋白质127个，含双精氨酸信号肽的蛋白13个， 含脂蛋白信号肽的蛋白38个，非经典分泌蛋白380个。统计发现 69．9％的分泌蛋白的等电点大于7，并对分泌型信号肽的长度分布、 氨基酸使用频率和酶切位点的氨基酸使用频率作了统计。得分最高的 100个非经典分泌蛋白中，有36个具有功能分类，主要是参与细胞 硕士学位论文 硕士学位论文 摘要 壁、能量代谢及转运和结合的蛋白质。嗜酸氧化亚铁硫杆菌的这462 个分泌蛋白所参与的生化过程可能发生在膜外的周质空间或是菌体 外的场所，为该物种与矿物相互作用，以及对环境做出响应服务。 关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌，IscU，铁硫簇组装蛋白，分泌蛋白，信 号肽 U 硕士学位论文ABSTRACT 硕士学位论文 ABSTRACT Acidithiobacillus ferrooxidans“．ferrooxidans)iS one of the most studied microorganisms commonly found in bioleaching and acid mine drainage．Understanding the respiration of iron and reduced sulfur compounds is of wide interest,not only scientifically,but also from all economic and environmental point of view．To gain further insight into the physiological role of the known redox proteins and to help identify yet unknown or missing components involved in iron and sulfur respiratory chains