用于活体影像技术稳定转染肺癌细胞系建立及体外验证.pptVIP

一，研究背景及目的： 癌症极大的威胁着人类的健康，世界卫生组织最新数据表明，到2010年，癌症将成为导致人类死亡的第一病因。中国是世界上肺癌患者最多的国家，根据卫生部公布的统计资料，我国肺癌的死亡率已经高达30.83/10万，与30年前相比上升了465%，肺癌已取代肝癌成为中国首位恶性肿瘤死亡原因。因此,对肺癌转移的研究已成为当前的热点之一,利用免疫缺陷动物建立人类肿瘤动物模型正是研究肿瘤转移生物学和抗转移实验治疗的重要工具.  活体成像技术可以利用活体生物发光或荧光成像直接检测活细胞在动物体内的生物学行为。荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞，在活体成像技术中也得到了广泛的应用。研究表明带有Luciferase 基因的肿瘤细胞在动物体内成瘤之后, 借助于灵敏的活体成像系统, 通过检测Luciferase 发光强度, 可间接反映出细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置。活体成像技术已经成为近年来动物模型研究最重要的进展。 本研究采用PRC/CMV2[luc+/neo]质粒转染人非小细胞肺癌细胞株A549，经G418筛选后获得稳定表达荧光素酶的单克隆细胞株A549- luc+，经体外及体内相关生物学特性鉴定，探讨这些经荧光素酶修饰的细胞株是否可作为活体监测肿瘤转移及药物治疗疗效的模型,为肺癌生长及转移机制的研究和药物开发提供了新的有用工具。 1. PRC/CMV2- luc+ 载体的构建及鉴定用限制性内切酶对PGL3-Promoter质粒和PRC/CMV2质粒进行双酶切，酶切位点为HindⅢ和XbaⅠ。将从PGL3-Promoter质粒上酶切得到的luciferase基因（大约1.7kbp）和PRC/CMV2质粒酶切产物（约5.5kbp）进行连接。对新构建的真核表达载体PRC/CMV2- luc+双酶切鉴定。  2. 稳定抗性克隆细胞的获得及荧光素酶活性测定： 取对数生长期的A549细胞，转染前一天将细胞接种于6孔板，24h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染。转染按照LipofectamineTM试剂操作手册进行操作。每孔Lipofectamine2000 8ul,质粒DNA4ug.转染后细胞置于培养箱常规培养。  转染24h后根据预实验选定的G418筛选浓度加入G418（设立三个浓度梯度：800ug/ml,900ug/ml,1mg/ml,两个复孔），同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照。每天观察细胞，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液和换药。如此重复操作，大概10-14d左右，待对照组细胞全部死亡后，即初步得到单个细胞的克隆。将经过G418筛选初步得到的单克隆A549- luc+细胞（48个）接种到24孔板，接种密度为1×105/孔， 24h后裂解细胞，收集裂解物，各取10ul加入96孔白板中，每个克隆细胞设2个复孔。每空加入50ul荧光素酶底物，96孔板荧光光度计测荧光值（RLU）。比较RLU值的高低，从高往低留取8个RLU值较高的单克隆细胞继续传代培养，其余的淘汰。细胞每传5代就检测一次，每次检测保留RLU值比较高而且稳定的克隆细胞。重复此筛选过程，直至细胞传代至第40代为止，即可得到稳定表达荧光素酶的A549- luc+细胞。 将最终筛选得到的A549- luc+细胞消化，D-Hanks制成细胞悬液，细胞计数后，每孔100ul加入96孔白板中，以每孔1×105，5×104，2.5×104，1.25×104，5×103，1000，100的细胞数接种于96孔板，设置3个复孔。24h后用D-Hanks冲洗后加入D-Luciferin底物，使终浓度为150ug/ml。室温避光放置2-3min后利用活体成像系统观察，并比较平均光密度值和总光子数与细胞数之间的相关性。 3. Luciferase基因表达的检测：分别提取未转染PRC/CMV2- luc+质粒的A549细胞和转染PRC/CMV2- luc+质粒但荧光素酶值比较低的A549-luc+细胞以及经过筛选最终得到的稳定表达荧光素酶的A549- luc+细胞的RNA，逆转录后，做荧光定量PCR检测，比较三种不能细胞株之间luciferase基因的表达差异。 4.裸鼠皮下移植瘤模型的建立及动态观察：裸鼠，4-5周龄，体重（16±2g），雌性。取对数生长期的A549-luc+细胞，每只接种2×106个细胞/100ul于裸鼠右侧前肢近腋部皮下 ，共接种三只。用德国BERTHOLD公司的活体成像系统观察肿瘤的生长情况。观测时小鼠先腹腔注射戊巴比妥那麻醉（计量为：50mg/kg），待小鼠麻醉后，腹腔注射荧光