《MTT法》-课件设计(公开).ppt

MTT法 一、原理 噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、试剂材料准备与实验仪器 1）对数生长期细胞2）受试因素（药物或细胞） 3）Actinomycin D 4）MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽虑除菌，避光 保存在4?C 5）DMSO（二甲基亚砜）6）96孔板7）酶联免疫检测仪8）细胞培养箱 三、实验步骤 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，将待测细胞(L-929)调密度至3×105/ml，含10% FCS的完全培养基，100?l/孔，（边缘孔用无菌水填充），5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。 2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁过夜。 3）吸掉上清，每孔加80?l无FCS的1640，每板设对照（加90?l 1640）。 4）加Actinomycin D（有毒性）10ul。用无FCS的1640稀释 (储存液100?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1：20) 5）加入不同浓度的待测物10ul，以sTNF为例，加入2000U/ml，1000U/ml，500U/ml，200U/ml，100U/ml，50U/ml，10U/ml。（在终体积为100ul的96孔板内，终浓度为200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，1U/ml，所加入的试剂均需考虑加入浓度和终浓度。） 6）5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 7）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。8）终止培养，小心吸去孔内培养液。9）每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。10）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照。 2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞可使用WST-1，XTT等，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。5）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 四、结果统计学处理 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 细胞死亡率% = OD对照组 五、注意事项与常见问题 1）实验时应设置对照孔，加药孔。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT按照10%的比例加入。 4）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。5）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，570nm有最大吸收值，并且建议以630nm作为参考波长。 6）96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增