生姜蛋白酶的生物大作分子修饰.pptVIP

; ; ; 文章结构; 材料与试剂： 生姜（市售鲜生姜）；单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)；右旋糖苷(dextran40000)；三聚氯氰(C3Cl3N3)；高碘酸钠；2,4,6- 三硝基苯磺酸 (TNBS)；硼氢化钠；聚乙二醇(PEG20000) 仪器与设备： PHS-3C 精密pH 计；THZ-82 型数显式电热恒温水浴锅 厂；HJ-3 型数显恒温磁力搅拌器；TU-1810 紫外- 可见分光光度计 LGJ-18A 型冷冻干燥机 ;方法： 生姜蛋白酶的制备： 1.将新鲜生姜洗净、切丁，每1kg 生姜加入4℃预冷的磷酸缓冲液2L。用高速组织捣碎机搅碎制成匀浆，离心弃渣取上清液。 2.将离心姜液进行超滤处理，得到相对分子质量大于10000、小于50000 的生姜蛋白酶浓缩液。将生姜蛋白酶浓缩液与4℃预冷的丙酮按一定的比例混合（数据来源于本文参考文献），离心弃上清液，取沉淀自然风干，制得生姜蛋白酶粗粉。 3.将生姜蛋白酶粗粉用磷酸缓冲液溶解后，经葡聚糖凝胶G-200 和二乙氨基乙基纤维素DE52 进行两次柱层析纯化，透析脱盐后经冷冻干燥得到生姜蛋白酶纯品 ; 生姜蛋白酶活力的测定 原理： ?生姜蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，在碱性环境下，酪氨酸与福林试剂作用产生有色物质，于波长660nm 处进行光密度(OD)测定。 ?光密度与酪氨酸的浓度成正比。 ?酪氨酸的量来表示生姜蛋白酶分解蛋白质的能力。 （在这里笔者定义：在40℃、pH6.0 条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸，定义为1 个蛋白酶活力单位。具体测定方法参见SB/T 10317 — 1999《蛋白酶活力测定法》。）;单甲氧基聚乙二醇对生姜蛋白酶的修饰 单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的活化： 采用三聚氯氰活化法[7-8]（此处笔者仅提供了参考文献） 活化mPEG 化学修饰生姜蛋白酶的制备： ?在酶液质量浓度为2.0mg/mL 的生姜蛋白酶硼酸缓冲液中，加入一定比例的活化mPEG 修饰剂，于40℃水浴中保温反应lh; ?磷酸缓冲液(0.lmol/L，pH7.0)中透析24h，用截留相对分子质量为10000 的超滤膜超滤，截留浓缩液，冷冻干燥即得mPEG 修饰的生姜蛋白酶。 ?。通过酶修饰率和修饰酶的活力测定，探讨活化mPEG 的用量和pH 值对修饰效果的影响。; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;